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医学免疫学检验-免疫荧光技术课件VIP免费

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医学免疫学检验-免疫荧光技术课件篇一:免疫荧光技术简介免疫荧光技术简介技术支持|浏览次数:416|时间:2022-2-22PriCells-免疫荧光技术(Immunofluorescencetechnique)1941年,Coons等于首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术(fluorescentantibodytechnique)。该技术的主要特点是:特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是:非特异性染色问题尚未完全解决,结果判定的客观性不足,技术程序也还比较复杂。一、荧光免疫技术的概念:免疫荧光技术(Immunofluorescencetechnique)又称荧光抗体技术,是标记免疫技术中发展最早的一种。将抗原或抗体用荧光素进行标记,标记的抗原或标记的抗体与相应的抗体或抗原反应后,测定复合物中的荧光素,这种免疫技术称为免疫荧光素技术。免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。二、荧光免疫技术分类:(1)荧光抗体显微镜技术:抗原抗体反应后,利用荧光显微镜判定结果的检测方法。(2)免疫荧光测定技术:抗原抗体反应后,利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法三、荧光的产生:物质吸收外界能量而进入激发状态,在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放,即发光,这种光称为荧光。这种物质,称为荧光素。由光激发所引起的荧光,为光致荧光;由化学反应所引起的荧光,为化学荧光。四、荧光素的荧光特性:(1)停止供能,荧光现象随即终止(2)对光的吸收和荧光的发射具高度选择性入射光波长<发射光波长(3)荧光效率:荧光效率=发射荧光的光量子数/吸收光的光量子数(4)荧光猝灭现象:荧光素的辐射能力减弱五、常见荧光素:(1)异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC):FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末,易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体,其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4,最大吸收光波长为490~495nm,最大发射光波长为520~530nm,呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年,是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感,通常切片标本中的绿色荧光少于红色。(2)四乙基罗丹明(rhodamine,RB200):RB200为橘红色粉末,不溶于水,易溶于酒精和丙酮,性质稳定,可长期保存。最大吸收光波长为570nm,最大发射光波长为595~600nm,呈现橘红色荧光。(3)四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocynate,TRITC):TRITC为罗丹明的衍生物,呈紫红色粉末,较稳定。最大吸收光波长为550nm,最大发射光波长为620nm,呈现橙红色荧光,与FITC的翠绿色荧光对比鲜明,可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢,也可用于单独标记染色。(4)镧系:镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕(Eu3)、铽(Tb3)、铈(Ce3)等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光,其中以Eu3应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽,发射光波长范围窄,荧光衰变时间长,最适合用于分辨荧光免疫测定。(5)藻红蛋白(P-phycoerythrin,PE):PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素,分子量为240kD的蛋白,最大吸收峰为564nm,当使用488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm,对于单激光器的流式细胞仪来说,推荐使用585±21nm的带通滤光片,双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。(6)多甲藻叶绿素蛋白(peridininchlorophyllprotein,PerCP):PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的,是一种蛋白复合物,分子量约为35kD,最大激发波长的峰值在490nm附近,当被488nm氩离子激光激发后,发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。(7)碘化丙啶(propidiumiodide,PI):可选择性地嵌入核酸(DNA、RNA)的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时,需用RNase对细胞进行处理,以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响。在488nm波长激发下,PI的发射光谱为610-620nm。FL2探测器检测PI。常见荧光素的特性:(1)FITC:黄色结晶粉末,吸收光:490~495nm,发射光:520~530nm,明亮的黄绿色荧光。(2)RB200:橘红色粉末,吸收光570nm,发射光595~...

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