乙型肝炎病毒(HBVDNAPCRABI7300)检侧标准操作程序一、INFORMATIONFORTEST检测信息项目名称方法方法依据乙型肝炎病毒核酸聚合酶链反应卫生部《全国临床检验操作规程》第三版（2006)第七篇第六章第一节二、ANALYTICALPRINCTPLE检测原理聚台酶链式反应（PCR〕可对特定核苷酸片段进行指数级的扩增，而实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，荧光物质有两种：荧光探针和荧光染料。我们目前是使用TaqMan荧光探针的检测原理：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’一3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成，荧光信号强度也等比例增加（图一）.这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。三、操作步骤(一）试剂配制1、进入试剂准备区，开启冰箱冷冻层取出HBV-DNA检测试剂盒.查看外包装盒（包括生产批号、有效期)，无误后拆开试剂盒,取出核酸提取液、反应液及Taq酶(核对核酸提取液、HBVPCR反应液及Taq酶管上批号与试剂外包装盒批号是否一致）（图1），不一致则不可使用，需更换新的试剂。室温平衡20min，完全融化后2000rpm离心备用。2、核酸提取液的分装（1）取0.5ml离心管架置于超净工作台内（开机前用紫外线消毒30分钟），用右手拿起镊子逐个将离心管放入离心管架(注意应夹住离心管外壁，不能碰到管内壁)，摆放顺序为横列从左往右摆，竖列为从上往下隔行排，离心管个数为n(n=样本数+对照品+质控品）。完成后将镊子放回原位（图2）.（2)用移液器准确吸取核酸提取液50ul分装至0.5m1离心管中（左上角第一排开始，从左住右依次加入）。因核酸提取液内含固体沉淀颗粒物,为使颗粒均匀分布，故每次取样时都要用移液器反复吸打3-4次（图3)。分装完毕后将移液器量程归位。（3）加完一架后用右手拿镊子将离心管拿起，左手大拇指和中指夹紧离心管下部，然后用食指将盖子盖上，顺序为:从右下角第一个开始，从右住左依次盖上(图4），离心管盖全部盖完后，通过传递窗转移至标本处理区。3、HBV—DNA反应液的配制每批需设置空白对照、阴性对照、临界阳性对照（同时检测低值阳性质控品，则无需再检测临界阳性对照〕、阳性质控品、阳性标准品.所需每批需配制数n=样本数+对照品+阳性标准品+质控品，每个测试反应体系配制如下表：试剂用量（ul）HBVPCR反应液35.7Taq酶0.3（1)每盒HBV-DNA试剂可检测32人份,根据每日需检测标本份数计算出每批所需HBVPCR反应液和Taq酶用量（例有111人份需要进行检测,则有3盒试剂可直接使用10ul移液器将Taq酶加入HBVPCR反应液中,另有111—3*32=15人份试剂需将HBVPCR反应液和Taq酶使用移液器按反应体系比例吸取至1.5m1离心管中配制(图5）.（2）取出离心后备用的HBVPCR反应液和Taq酶，按上述要求配制后用旋涡振荡器振荡混匀5-10sec,然后再用离心机2000rpm离心10sec备用(图6）。（3)从操作台面上拿取HBV-DHA试剂配制盒（可选用空余的200u1枪头盒）至超净工作台内，打开配制盒并用记号笔在相应的孔位右旁按顺序编号(图7）。编号规则为:样本扩增反应管对应的孔位按相应的样本流水号编写、阳性质控品反应管对应的孔位编“Q”（如有高值则标为H，低值为L），阴性对照品孔位编“-”，临界阳性对照对应的孔位编“±”,空白对照对应的孔位编“B”,1号标准品对应的孔位编“S1",2号标准品对应的孔位编“S2”，依此类推。(4）编号完毕后，用右手拿起镊子夹起反应管(ABI7300使用的是八联一薄壁反应管,镊子应夹住反应管外壁，不可接触到内壁。按（图8）所示方向依次将所有反应管（反应管数=n）隔列摆放到配置盒上。(5)从离心机中取出已混好Taq酶的PCR反应液，用移液器（量程调至36ul)，准确吸取反应液并按从上到下、从左至右的顺序...
