大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化VIP免费

8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点,是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建8.1.1表达载体的选择根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lacoperator，T5/lacoperator等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括Poly-Arg，Poly-His,Strep-TagⅡ，S-tag，MBP等。其中His-Tag和GST-Tag是目前使用最多的。HisTag大多数是连续的六个His融合于目标蛋白的N端或C端，通过His与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。His标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用的表达载体主要是由Novagen提供的pET系列和Qiagen公司提供的pQE系列。除了His标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。此外，与His相比，GST很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。当然，GST具有较大的分子量（26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。目前，GST融合表达系统主要是由GEHealthcare（原Amersham）提供。8.1.2宿主菌的选择重组质粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，质粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coliDH5α，E.coliJM109，E.coliDH10B，E.coliNovaBlμe等recA–和endA–型细胞。作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。以下是实验室常用的几种表达宿主：BL2：lon和ompT蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体。适用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作为启动子的载体。BL21（DE3）：DE3噬菌体溶源于BL21形成的带有染色体T7RNA聚合酶基因大肠杆菌。IPTG诱导的lacΜV5启动子控制T7RNA聚合酶基因表达T7RNA聚合酶，进而控制T7表达系统表达目的蛋白。BL21（DE3）衍生系列：在经典的T7表达系统BL21（DE3）的基础上，Novagen公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。比如：Origami（DE3），OrigamiB（DE3）和Rosetta-gami（DE3）菌株带有trxB和gor双突变。拥有trxB和gor突变的菌株比单具，trxB突变的菌株更有可能促进二硫键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。Rosetta™系列：是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。经提高稀有tRNA水平，可以提高一些真核基因表达效率（更多信息可参考相应公司的资料）。BL21-CodonPlus系列：包括BL21-CodonPlus®（DE3）-RIPL，BL21-CodonPlμs®-RIL，BL21-CodonPlμs®（DE3）-RIL,BL21-CodonPlμs®-RP，BL21-CodonPlus®（DE3）-RP等。这些受体菌添加了大肠杆菌中编码精氨酸（R），亮氨酸（L），异亮氨酸（I）和脯氨酸（P）稀有密码子的tRNA基因，更多用于表达一些真核生物的基因。其中RIL系列常用于AT含量高的基因，而RP系列主要用于GC含量高的基因（更多信息参考Stratagene公司资料）。M15/SG13009：自身表达T5RNApolymerase，主要用于pQE系列载体的表达。另一个需要考虑的是大肠杆菌的密码子及其偏爱性。表1...