一、实验方案设计实验序号实验项目大肠杆菌生长曲线的测定实验时间2012.6.4实验室生化楼327小组成员一．实验目的1.通过对大肠杆菌生长曲线的测定，了解细菌生长的特点，综合训练微生物实验的基本实验技能。2.巩固培养基的配制、灭菌、仪器的包扎、倒平板。3.掌握用比浊法测定细菌的生长曲线。二．实验原理、实验流程或装置示意图将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，一定时间测定培养液中的菌量，以菌量的数量作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、生长期、稳定期和衰亡期。将每一种一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段。延迟期：又叫调整期。细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡）。此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少延迟期长短因素种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为1～4小时。此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物。对数生长期：又称指数期。此期生长曲线上活菌数直线上升。细菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小时至几天不等（视培养条件及细菌代时而异）。此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研究细菌性状以此期细菌最好。抗生素作用，对该时期的细菌效果最佳。稳定期：该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大细菌浓度达到最大即环境最大容纳量。由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、过氧化物等）积累PH下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度渐趋下降，相对细菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。细菌形态、染色、生物活性可出现改变，并产生相应的代谢产物如外毒素、内毒素、抗生素、以及芽孢等。衰亡期：随着稳定期发展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形。生理代谢活动趋于停滞。故陈旧培养物上难以鉴别细菌。体内及自然界细菌的生长繁殖受机体免疫因素和环境因素的多方面影响，不会出现象培养基中那样典型的生长曲线。掌握细菌生长规律，可有目的地研究控制病原菌的生长，发现和培养对人类有用的细菌。这4个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所不同。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解个菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简单。三．实验设备及材料大肠杆菌斜面菌种、营养肉汤培养基、生理盐水（0.85%NaCl）50mL、721型分光光度计、比色皿、恒温摇床、培养箱、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、酒精灯、电炉、接种环、试管架、锥形瓶15个（250mL）、无菌吸管、烧杯（1000mL）、乳胶头、报纸、胶塞、玻璃棒等四．实验方法步骤及注意事项实验步骤:配制营养肉汤培养基营养肉汤培养基灭菌配制大肠杆菌菌液标记接种培养测定绘制生长曲线1.配制营养肉汤培养基:用电子天平称取14.4g营养肉汤粉末置于1000mL烧杯中，加水至800mL，用电炉加热(加热过程中要用玻璃棒不断搅拌)至沸腾后，冷却少许后分别倒进15个锥形瓶中，每个锥形瓶倒50mL，塞上胶塞，用报纸包好，棉绳系好。2.营养肉汤培养基灭菌:将步骤一包好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min.3.配制大肠杆菌菌液:取大肠杆菌斜面菌种一支，在酒精灯火焰上方操作，用接种环刮取少量菌苔于约50mL生理盐水中，充分震荡均匀。4.标记:将15个锥形瓶进行标记，分别标号1、2、3……14、15.5.接种:用1mL无菌移液管分别移取1mL大肠杆菌菌液到已编号的15个锥形瓶...
