实验技术原理：IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proreinA"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。实验操作流程：1.样品准备：1）取细胞加入500μl上样Buffer(无溴酚蓝)和50ul10mg/mlPMSF，混匀，超声波破碎细胞2）4℃，12000rpm离心10min3）取上清夜，-70℃冻存24hr5）4℃12000rpm再次离心10min，取上清分装，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100℃加热4min，后于-20℃保存待用。2.定蛋白及计算电泳上样量：根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量，电泳上样量定为40ug3.免疫沉淀：1）准备A蛋白-Sepharose珠：用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠2）准备A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物：按每50μlA蛋白-Sepharose珠中加入10ul一抗，4℃孵育1h，8000rpm离心5min，PBS洗涤3次，加50ulPBS3）取100μg总蛋白，加入50ulA蛋白-Sepharose珠.一抗复合物，4℃轻摇2h，PBS洗涤3次，之后加入50ul1×SDS凝胶上样缓冲液，100℃变性3min，以游离抗原、抗体、珠子，8000rpm室温离心5min，蛋白上清储于-20℃备用。4.电泳：1）安装好电泳装置2）根据不同的指标配制相应浓度的分离胶，灌胶约3/5体积，液封(<10%用0.1%SDS,>10%用异丙醇)3）30min后，待凝后倾去封液4）配5%的浓缩胶，灌胶至距平板顶部2mm处，插入梳子,30min后，待凝后拔出梳子，用去离子水清洗加样孔，用滤纸吸干5）上样：各样品取50ug上样，marker取10μl上样(上样前需按说明书进行预处理)6）缓慢加入内、外槽缓冲液，接通电源，90v电泳至指示剂进入分离胶后，调电压至150V继续电泳7）当指示剂距平板底端1cm处时停止电泳5.转膜及检测:1）准备2个Φ12cm的平面皿，一个装去离子水浸泡NC膜20min，另一装转移缓冲液浸泡海绵和滤纸20min2）取下胶，切除浓缩胶部分后，将分离胶浸入转移缓冲液中约5min3）按顺序安装好转膜装置（黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维膜-三层滤纸-海绵-红色板）4）完全排除气泡，4℃，100mA转膜2hr。5）倾去转膜缓冲液，拆除转膜装置，将硝酸纤维膜放入丽春红中摇床染色15min，用去离子水清洗至能看到条带，后用铅笔标出marker位置，再用去离子水震荡以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右6）将膜转移至另一容器中，用5%脱脂奶粉封闭,4℃过夜7）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的一抗8）37℃摇床孵育约2hr9）PBST洗涤4次，每次5min10）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的二抗，37℃摇床孵育约30min11）PBST洗涤4次，每次5min12）将膜转移至尽可能小的容器中并加入预先配制好的化学发光底物（A液与B液等体积混和），室温孵育5min后13）取出NC膜，去尽残液，包好，放入X-光片夹中显影14）扫描及分析实验具体收费、标本的收集、实验试剂的定购等事宜，请联系嘉美生物。实验预约热线：400-698-4168010-58464308010-58464306实验预约邮箱：jiamei_bj@126.cominfo@jiamay.com中国生命科学实验技术服务、定制高端平台——嘉美生物实验技术中心嘉美生物是一家主要从事AnnexinV,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,磷酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司。相关文章芯片类检测：Luminex\PLEXMAP\BIOPLEX液相芯片检测实验服务细胞生物学实验：流式分选外包服务免疫学实验：流式CBA多因子检测外包实验分子生物学外包服务：个性化治疗分子检测外包服务热点实验服务：国家自然科学基金等基金的申请外包服务热点实验服务：大陆核心期刊三包服务（实验、撰写、发表）原代细胞培养服务：原代细胞分离培养鉴定以及检测等整体课题服务原代细胞培养服务：原代肝细胞定制服务
