GPNMB促进周围神经损伤修复的作用及其机制周围神经损伤是临床常见损伤,损伤后的再生修复涉及很多因素,其中施万细胞(Schwanncells,SCs)在周围神经损伤修复中发挥着重要的作用。周围神经损伤后,SCs通过上调多种神经营养因子(neurotrophicfactors,NTFs)和粘附分子的表达,并在损伤局部募集巨噬细胞,与巨噬细胞共同吞噬裂解的轴突和髓鞘,改善再生微环境;在基膜内形成Büngner’s带,引导轴突再生;轴突再生后,SCs包绕其形成髓鞘,促进神经功能恢复。损伤远侧端SCs长期失神经,则导致周围神经再生能力下降,影响神经修复。因此,激活失神经SCs,促进SCs增殖、分化、迁移、表达和分泌NTFs等,或者通过补充外源性营养因子、小分子物质等改善再生微环境,是治疗周围神经损伤的重要策略。非转移性糖蛋白黑色素瘤蛋白B(GlycoproteinNon-MetastaticMelanomaProteinB,GPNMB),也叫骨活化素(osteoactivin,OA)、树突状细胞肝素整合素配体(dendriticcell-heparinintegrinligand,DC-HIL)、造血生长因子诱导的神经激肽-Ⅰ型(hematopoieticgrowthfactorinducibleneurokinin-Ⅰtype,HGFIN),是一种Ⅰ型跨膜蛋白,最早发现于黑色素瘤细胞中。GPNMB广泛分布于中枢神经系统,具有非常重要的作用:如改善记忆、抗炎、减少神经元死亡、保护神经元。GPNMB在周围神经系统特别是SCs也有表达,然而,它对SCs和周围神经系统是否有激活或者保护作用,以及在周围神经再生修复中的作用仍不清楚。基于以上考虑,本研究通过对坐骨神经损伤后远侧端进行基因芯片分析,了解GPNMB在周围神经损伤后的表达变化,并探讨GPNMB对周围神经损伤再生修复的作用和对SCs的作用及其机制,为GPNMB的临床应用提供理论和实验基础。第一部分坐骨神经损伤后GPNMB的表达变化目的:通过对坐骨神经损伤后远侧端进行基因芯片分析,以了解损伤神经远侧端基因表达变化,尤其是GPNMB的表达变化。方法:对坐骨神经横断伤后0、1、3、7、14、21、28d,远侧端进行基因芯片分析,STEM分析筛选表达变化趋势显著性的基因集,并对其进行生物信息学分析和聚类分析。筛选出其中变化最明显的基因,并使用qRT-PCR、免疫印迹(Westernbloting,WB)、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)对其在转录和蛋白水平进行验证。结果:在坐骨神经横断损伤后0、1、3、7、14、21、28d,远侧端基因表达趋势显著性的基因集共有12个,其中基因集41的表达趋势在坐骨神经损伤后先上升、至峰值、继而下降,而这种变化趋势与远侧端急性失神经SCs的增殖趋势相一致。GO、KEGG分析预测基因集41中的基因可能参与细胞增殖过程。聚类分析发现GPNMB是基因集41中表达变化最明显的基因,其表达从1d开始上升、从3d开始迅速上升,至7d时上升至峰值,约为0d的48倍、从14d开始下降,直至28d下降至0d的15倍左右。qRT-PCR、WB、IHC结果显示GPNMB的表达趋势和芯片结果基本一致。结论:在坐骨神经损伤后,损伤远侧端GPNMB表达变化最明显,且呈先上升、至峰值、继而下降的趋势,GPNMB可能参与坐骨神经损伤后的自我再生修复过程,尤其是细胞增殖的过程。第二部分GPNMB促进坐骨神经损伤再生修复目的:探讨GPNMB对坐骨神经损伤再生修复的作用方法:坐骨神经重度压榨伤模型建模后3周,于损伤处由远及近、多点注射重组人GPNMB(rhGPNMB)蛋白或PBS,实验大鼠共分为3组:PBS组、100ngrhGPNMB组、500ngrhGPNMB组,并于4周后进行检测。免疫荧光检测SCs增殖及轴突、髓鞘的再生;透射电镜观察髓鞘的超微结构并计算G-Ratio值;体外检测损伤神经兴奋传导速度和动作电位振幅;注射rhGPNMB后的每周观察大鼠行走足印、计算坐骨神经功能指数,检测神经功能恢复情况;观察腓肠肌大体形态、对腓肠肌称重、HE染色检测其萎缩情况。结果:rhGPNMB组SCs数目、再生轴突数、再生髓鞘数以及增殖细胞核抗原的表达均明显多于PBS组,差异具有统计学意义。100ngrhGPNMB组和500ngrhGPNMB组的SCs数量分别为PBS组的1.55±0.21和2.75±0.28倍,且形状和排列上更加规则;再生轴突数为PBS组的1.38±0.19和1.78±0.18倍,且分布更加均匀、直径更大、延续性更完整;再生髓鞘数分别为PBS组的1.18±0.18、1.67±0.08倍,且完整性更好、分布更加均匀。透射电镜结果显示:rhGPNMB组再生髓鞘数多于PBS组,形状更...
