基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定（得到转基因生物）一、目的基因的获取主要是编码蛋白质的结构基因现代获取方法：1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、化学方法人工合成初始目的基因的来源从生物中直接获取人工合成1、从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库基因组文库部分基因文库(CDNA文库)基因组文库与部分基因文库的关系某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体思考：基因文库如何构建？限制酶与运载体连接导入基因组文库某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入部分基因文库（cDNA文库）思考：1、cDNA含有启动子，终止子，内含子吗？mRNARNA－DNA杂合双链单链DNA双链DNA（cDNA）DNA聚合酶逆转录酶(消化mRNA)思考：如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性。练习：下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中，不正确的是（）A．cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，基因组文库中含有某种生物的全部基因B．如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同C．cDNA文库中的基因都没有启动子D．一种生物的cDNA文库可以有许多种，但基因组文库只有一种B2、利用PCR技术扩增目的基因多聚酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。PCR扩增仪4循环1高温变性2低温退火(复性）3延伸PCR反应原理PCR技术原理：前提：条件：方式DNA双链复制一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）指数2n（1）模板DNA；（2）DNA引物；（3）四种脱氧核苷酸；（4）热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；过程：a、高温变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________b、低温复性（55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA子链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一细胞内复制体外PCR技术解旋方式解旋酶催化DNA在高温作用下变性解旋场所细胞内（主要在细胞核内）细胞外（主要在PCR扩增仪内）酶DNA解旋酶、普通DNA聚合酶耐热的DNA聚合酶（Taq聚合酶）温度条件细胞内温和条件需控制温度，在较高温度下进行合成对象DNA分子DNA片段或基因联系模板原料酶④引物PCR技术与生物体内DNA复制的比较：练习：下列属于PCR技术所需条件的是（）①单链的核苷酸序列引物②目的基因所在的DNA片段③脱氧核苷酸④核糖核苷酸⑤DNA连接酶⑥DNA聚合酶⑦DNA限制酶．A．①②③⑤B．①②③⑥C．①②③⑤⑦D．①②④⑤⑦B蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测3、化学方法人工合成：在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以通过DNA合成仪用化学方法人工合成。化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？编码区非编码区非编码区启动子终止子前mRNA(核糖核苷酸序列）(脱氧核苷酸序列）成熟mRNA(核糖核苷酸序列）转录翻译(氨基酸序列）蛋白质某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入部分基因文库（cDNA文库）二、基因表达载体的构建(基因工程的核心)1.基因表达载体的构建目的a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用p15思考1：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。...
