基因打靶技术介绍摘要：基因打靶技术于20世纪80年代后兴起，是建立在基因同源重组技术和胚胎干细胞技术基础上的一种分子生物学技术。它通过定向改变细胞或者生物个体遗传信息使得生物个体表达突变的性状，从而帮助人类理解生命现象的本质、揭示疾病发生的机理、探寻疾病预防和诊疗手段。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、可诱导性基因打靶系统的建立,使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确。目前,基因打靶技术在鼠胚胎干细胞中的应用已经很成熟。它的发展将为发育生物学、分子遗传学免疫学及医学等学科提供一个全新的研究手段。定义：基因打靶是指通过外源基因与受体细胞染色体基因组上的序列之间发生同源重组（基因同源重组是指外来的含已知序列的DNA片段通过同源关系与受体细胞基因组的相应片段发生交换、产生重组,并在受体细胞染色体上形成有活性的基因的过程）,将外源基因整合到某一定位点上,从而实现外源基因的定点整合、修饰和改造受体细胞遗传特性的技术手段。原理：首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。获得的带有特定修饰的突变动物提供给研究者一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能。基因打靶主要步骤：(一)打靶载体的构建基因打靶过程中，基因打靶载体的设计及构建是非常重要的，根据不同的目的，利用插人、删除、置换、修饰等手段对DNA序列进行重新构建。基因打靶载体包括靶基因的同源序列(目的基因)、用于筛选同源重组成功细胞的选择标记以及载体骨架三部分。根据双链断裂点位置的不同可分为插人和置换两种基本类型。插人型载体的断裂点在同源序列内，选择标记既可在同源序列内，也可在其外，重组的结果是将整个载体整合到靶位点上。由于打靶载体的插人干扰了靶基因的正常结构，从而使其失活。置换型载体的断裂点在同源序列的边缘或其外，选择标记在同源序列内，重组的结果是由载体上的同源序列取代内源靶序列。（二)打靶载体导入胚胎干细胞外源DNA导人的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等。电穿孔法是目前最常用的方法，适用于多种细胞，由于脉冲对细胞的电穿孔是瞬间的可逆现象，一般不影响细胞的功能[3]。显微注射法需借助于显微注射仪，将外源基因准确注人到细胞中，命中率较高，但技术难度大。逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力，可用于时空特异性基因打靶，在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。（三)基因打靶的筛选系统由于外源基因与靶细胞DNA可以发生同源重组或非同源重组，而且同源重组的发生频率远比非同源重组的低，故对同源重组的筛选和检测，是基因打靶的重要步骤。目前筛选的方案有数种，如正负双向选择法、标记基因的特异位点表达法及聚合酶链反应(PCR)法。其中用得最多的是正负双向选择法:体外构建打靶载体时，在靶基因的同源序列之间插人新霉素抗性基因(neo‘)作为正筛选的标志，在同源序列与非同源序列之间插人单纯疤疹病毒一胸苷激酶基因(HSV一tk)作为负选择标志。含有neo‘基因的克隆可以在含以18的培养基中生长，tk基因可以使无毒的丙氧鸟苷代谢为毒性物质，因而携有tk基因的克隆不能在含有丙氧鸟昔的培养基中生长。将打靶载体导人细胞后，若发生随机整合，neo‘和tk基因会同时整合至基因组中，随机整合的细胞将被杀死，而发生同源重组的细胞tk基因被删除，仅有neo‘基因整合人基因组，在药物G418和丙氧鸟苷的双重筛选下仍能存活。（四）鉴定观察被击中细胞的生物学特性,并进行分子生物学检测可以用特异PCR方法鉴定,PCR引物一端以基因组DNA的特定基因座为模板,另一端以导入的外源基因为模板,这样保证扩增后的片段为同源重组产生的特殊片段。对经PCR鉴定的克隆用Southern杂交产生特殊带谱的方法来进一步确定同源重组克隆。基因打靶技术的应用：基因功能和基础理论研究...
