鞭毛染色法及活菌活动性观察第一页，共十页。一、实验目的及要求了解细菌鞭毛染色的原理，掌握鞭毛染色的方法；学习用压滴法观察细菌的运动性。第二页，共十页。二、实验原理细菌的鞭毛极纤细，直径一般为0.1—0.2um，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色的基本原理是：即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。第三页，共十页。采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果仅须了解某菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或压滴法直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。此法较快速、简便。悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有凹槽的载玻片中央，即可放置在普通光学显微镜下观察。压滴法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。第四页，共十页。三、实验器材1.菌种：苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单细胞菌2.染色液和试剂：硝酸银染色液、香柏油、二甲苯、0.01％美兰水溶液。3.仪器、材料：载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、镊子、接种环，显微镜。第五页，共十页。四、实验方法（一）硝酸银染色法1.清洗玻片选择光滑无裂痕的玻片，置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20min。取出用清水冲洗，沥干水后，置95%乙醇中浸泡，用时取出在火焰上烧去酒精。2.菌液的制备：菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上连续移接3-5代，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱中培养12—16h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛有1—2mL无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放在37℃恒温箱中静置10min（放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。第六页，共十页。3.制片：吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。4.染色①滴加A液，染3-5min；②用蒸馏水充分洗净A液；③用B液冲去残水，再加B液于玻片上覆盖染色数秒至1min，必要时在酒精灯微火加热直至显褐色，立即用蒸馏水洗，自然干燥。5.镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。第七页，共十页。（二）压滴法1.制备菌液：从幼龄菌斜面上，挑数环菌放在装有1－2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。2.取2－3环稀释菌液于洁净载玻片中央，再加入一环0.01%的美蓝水溶液，混匀。3.用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，防止产生气泡。4.镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。第八页，共十页。五、实验报告绘图表示鞭毛细菌的形态特征，并用箭头表示其运动方向。六、思考题1.鞭毛染色法准确鉴定细菌是否具有鞭毛要注意的细节。2.压滴法中，发现视野内大量的细菌朝一个方向运动，原因何在？第九页，共十页。内容总结鞭毛染色法及活菌活动性观察。细菌的鞭毛极纤细，直径一般为0.1—0.2um，只有用电子显微镜才能观察到。压滴法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。取出用清水冲洗，沥干水后，置95%乙醇中浸泡，用时取出在火焰上烧去酒精。5.镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。3.用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，防止产生气泡第十页，共十页。
