第八课双向凝胶电泳VIP免费

第八课双向凝胶电泳•概述•原理------IEF，SDS-PAGE•双向凝胶电泳分离操作•双向凝胶电泳检测•双向电泳分离技术的优缺点•DIGE技术一、双向凝胶电泳概述双向电泳的思路最早由Smithies和Poulikc提出，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率(free-solutionmobility)，在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。随着聚丙烯酰胺凝胶的发明，双向电泳支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶，即双向凝胶电泳。1969年，双向凝胶电泳在原理上有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦的双向凝胶电泳建立起来(即IEF-PAGE)。20世纪70年代初，第二向电泳中使用了十二烷基硫酸钠(SDS)，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了现代双向凝胶电泳的基础(即IEF-SDSPAGE)。1975年，O‘FarrellL、Kloset和Scheele分别对双向凝胶电泳做进一步的优化，建立了高分辨的双向凝胶电泳。双向电泳分析中的样品制备制备原则：•应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。•防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。•防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。•完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。•尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。可溶性样品固体组织样品细胞不同样品的基本处理方法样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。样品的溶解•是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。•溶解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。增加样品溶解性的手段变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂TritonX-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。样品中核酸的去除•对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。•解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。亚蛋白质组样品的制备•用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。•顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。第一步：用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用标准IEF样品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。特殊样...