第三章细胞工程的技术基础2第一节基本设备第二节基本技术3第一节基本设备一设备与器材二器材处理4一、设备与器材●大型设备类：无菌室、超净工作台、无菌箱、CO2培养箱、倒置显微镜、实体镜、高速离心机、超速低温离心机、冰箱、超低温冰箱、液氮装置。567培养箱8910光照培养室1112显微镜室1314151617181920●消毒灭菌设备：蒸汽压力消毒器、电热干燥箱、过滤除菌装置、离子发生器、耐酸耐碱容器、吸管自动冲洗器、超声波清洗器；21灭菌室2223242526●配液用具：水纯化装置、离子交换树脂装置、电子天平、磁力搅拌器、蒸发器等；●制备、培养、保存细胞用品：解剖器具、80～200目尼龙网或不锈钢网、血细胞计数板、培养器皿、细胞培养板（不同孔数）、涡流混悬器、恒温水浴振荡器、细胞冻存管、玻璃安瓿、真空低温干燥器、厚质玻璃容器等。27282930313233343536二、器材处理玻璃器皿的清洗：浸泡→刷洗→浸酸→冲洗橡胶用品的处理：冲洗→碱煮→冲洗→浸酸→冲洗→蒸煮●清洗除菌滤器的处理：高压灭菌塑料器皿的清洗：冲洗→碱浸→冲洗→酸浸→冲洗→漂洗金属器械的清洗：汽油→去脂→洗净→酒精擦→蒸煮或高压灭菌●包装：包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃等，避免消毒后再污染；●消毒灭菌：干烤、高压蒸汽灭菌、滤过除菌、紫外线、γ射线、（甲醛）熏蒸消毒、化学消毒剂、抗生素消毒灭菌。37一、无菌技术1.各种灭菌方法及其适用范围A湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌法、常压蒸汽灭菌法、间歇灭菌法）B干热灭菌法（火焰灭菌、干热灭菌）C电离辐射灭菌D紫外线杀菌E过滤除菌F化学杀菌G熏蒸灭菌法第二节基本技术382.无菌操作过程A清洗玻璃器皿的清洗实验材料的清洗B灭菌※培养材料的灭菌以药剂灭菌法为主主要考虑：药剂的灭菌效果、材料对药剂的耐受力394041※培养基灭菌高压蒸汽灭菌过滤灭菌C接种经过表面灭菌的材料，按不同的要求，经过剪切、整理后，移植到培养基上培养的过程。※接种室（无菌操作室）的灭菌※接种台的灭菌※工作人员注意事项423.实验室生物安全概念：指那些用以防止发生病原体或毒素无意中暴露及意外释放的保护原则、技术及实践。传染性微生物的危险程度分4级——1级、2级、3级、4级生物安全水平（BSL）相应的也分为4级——BSL1（基础实验室）BSL2（基础实验室）BSL3（防护实验室）BSL4（最高防护实验室）43二、细胞制备：机械分散法淋巴细胞分离：肝素抗凝血剂+Hanks稀释→分级分离→吸取→加其它培养液单细胞悬胰蛋白酶细胞T、B细胞分离：尼龙棉柱过滤B细胞粘附液的制备酶消化法分离法T细胞过滤胶原酶CD4/CD8细胞分离：SephadaG-10柱或流式细胞分选仪螯合剂分散法单核/巨噬细胞分离淋巴细胞不粘，（与玻面粘附）单核/巨噬细胞粘附44三、细胞计数法：血细胞计数板或器细胞分装；四、细胞培养与传代五、细胞形态学检查法：一般形态观察●利用倒置显普通染色观察（Giemsa染核）微镜观察法特殊染色法：DNA（Feulgen反应）、DNA-RNA（甲基-派洛宁）、糖（PAS）、脂（苏丹红II）、线粒体（詹纳斯绿B液）、叶绿体（吖啶橙）45吖啶橙：DNA、RNA●利用荧光显微镜观察法扫描免疫荧光染色透射●利用电子显微镜观察法：扫描或透射。六、无血清培养液的设计和合成七、细胞的冻存、复苏与运输八、细胞培养的放大试验（生产）九、细胞培养时污染的检测、排除46本章内容到此结束本章内容到此结束谢谢大家谢谢大家欢迎研讨欢迎研讨47【复习思考题】一．常用的灭菌方法有哪几类？概述它们的原理。二．判断题：1.已经洗净的仪器可以用布或纸擦干。2.无菌操作一般要求在酒精灯火焰前10-20cm范围内进行。3.过滤除菌的适用对象是易被高温破坏的材料如抗生素、糖、激素等试剂。
