第14章.同位素标记技术在分子生物学实验技术中的应用VIP免费

第14章.同位素标记技术在分子生物学实验中的应用中国农业大学齐孟文标记探针•探针（proble)带有检测标记的，与被检测目标物分子具有特异性互补反应性能的探测物分子或分子片断。•探针类别核酸探针DNA、RNA探针非核酸探针，抗体、蛋白质分子标签等核酸探针核酸探针DNA探针双链DNA探针单链DNA探针DNA探针cDNA探针RNA探针标记类别标记信号放射性标记32P，33P，3H,35S，125I，131I非放射性标记生物素、酶、地高辛配体、荧光素等。标记位置均匀标记非均匀标记如DNA末端标记标记核素核素半衰期衰变方式粒子能量/MeV粒子能量/MeV3H32P33P35S125I131I12.33a14.26d25.5d87.23d60d8.04的-(100)-(100)-(100)-(100)EC-(100)0.01861.7090.2480.1670.6050.3330.027-0.032标记单体•掺入DNA探针的常用单体标记化合物[-32p]dATP，[-32p]dCTP，[-32p]UTP，[-32p]ATP。国内供应商：北京福瑞国外供应商：UK标记单体•在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标记物主要是放射性同位素，如32P，33P和35S。在掺入核苷酸的标记过程中，只有三磷酸核苷酸的α位磷酸整合到核酸链中，因此使用α位磷酸被标记的三磷酸核苷酸，如[α-32P]dATP。而在标记5'末端磷酸基团的反应中一般使用γ位磷酸被标记的ATP。放射性的信号通过X-光片放射自显影或磷屏扫描获取。核酸探针标记法1.双链DNA探针⑴切口平移法首先用DNAaseI在探针DNA双链上造成缺口，然后借助于E.coliDNA聚合酶I的5`→3`外切酶活性，切去带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使同位素标记的互补核苷酸补入缺口。这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸,产生均匀标记的探针。切口平移反应受几种因素的影响:(a)产物的比活性取决于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b)DNA酶Ⅰ的用量和E.coliDNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c)DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性,故应使用仔细纯化后的DNA。切口平移法(2)随机引物法通过热变性使模板DNA变为单链DNA，随机引物与单链DNA退火后，利用KlenowFragment合成互补链。此时如果底物中dNTP的一种或几种被[α-32P],[α-35S],[3H]等标记时，那么合成的互补链DNA也被标记。合成后的双链DNA通过热变性变成单链后即可用作杂交探针。随机引物法•DNA标记法比较：切口平移法随机引物法反应时间延长反应时间会降低标记效率。必须确保反应时间。短时间内即可得到高比活性的探针。即使反应时间延长也不受影响。探针比活性～108dpm/μg～109dpm/μg模板纯度琼脂糖等抑制反应。即使有琼脂糖等混入，也相对不受影响。反应后纯化需要除去未反应的dNTP不需要除去未反应的dNTP模板量要求≥1μg≥25ng2.单链DNA探针⑴从M13载体衍生序列合成单链DNA探针M13噬菌体是一种单链DNA噬菌体，但它在感染宿主（大肠杆菌）后，在菌体细胞内复制成为双链并繁殖，又以单链形式透出菌体，再度感染新的宿主菌。将模板序列克隆到M13噬菌体,以特定的同用引物或人工合成寡合苷酸为引物，在[-32P]dNTP存在下，由Klenow片断酶促合成标记探针，反应完毕后，酶切长短不一的产物，然后通过变性凝胶电泳与模板分离。⑵从RNA合成单链cDNA探针用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种:a.寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA3‘末端序列。b.可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多,应预先尽量富集mRNA中的目的序列。反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段,经SephadexG-50柱层析即可得到单链探针。3.寡核苷酸探针若只知道待分离的目的基因编码的蛋白质产物，而对其核苷酸序列一无所知，即可设计合成寡核苷酸探针。利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。单一已知序列的寡核苷酸探针.种类许多...