河南农业大学硕士学位论文磺胺嘧啶单克隆抗体的制备及其在免疫学检测中的应用姓名：杨继飞申请学位级别：硕士专业：兽医学指导教师：宁长申;张改平20090401摘要磺胺嘧啶(Sulfadiazine，SD)是人工合成的抗菌药物，具有抗菌谱广、价廉、使用方便的特点，被广泛用于畜牧业生产中。同时磺胺嘧啶药物具有诸多副作用，它可在动物体内残留，并通过动物源性食品借食物链以低剂量传递，直接威胁到人类身体健康。检测SD残留的方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、联用技术、毛细管电泳法和免疫化学测定法等。免疫学分析技术以其灵敏、特异、快速、简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用。本研究内容主要包括SD人工抗原的合成：抗SD单克隆抗体(MonoclonalAntibody,mAb)制备；SD残留检测试剂盒研制和SD残留胶体金试纸研制等方面。通过分析SD分子结构和免疫原性，采用重氮化法将SD偶联于牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(oVrA)，合成人工免疫原BSA．SD和包被抗原OVA．SD，通过紫外扫描、SDS．PAGE和免疫小鼠后抗血清的ELISA鉴定，证明BSA—SD和OVA-SD偶联成功。用BSA．SD免疫BALB／c小鼠后，应用细胞融合技术筛选出1株高亲和力、高特异性杂交瘤细胞株(685．E4)。用体内诱生腹水法制各SDmAb。竞争ELISA测定其IC50为1．155pg／L，与磺胺甲基嘧啶(SMl)的交叉反应性为0．8％，与其它磺胺类同系物的交叉性均小于O．1％。应用SDmAb研制出SD残留竞争ELISA试剂盒，灵敏度为0．25弘g／L，线性检测范围为0～4ug／L；试剂盒对尿样的平均回收率为118．5％：对奶样的平均回收率为81．05％；对肉样的平均回收率为88．4％。研制的SD残留胶体金试纸(SD-Strip)，机读检测限为2¨grL，目测检测限为lOpg／L。两种产品均具有快速、敏感、特异、简便等特点，适合于SD残留快速检测的推广应用。关键词：磺胺嘧啶；单克隆抗体；ELISA试剂盒；胶体金试纸：残留6CHARACTERIZATIoNoFMoNoCLoNALANTIBoDIESAGAINSTSULFADIAZINEANDITSAPPLICATIoNINIMMUNoASSAYFoRRESIDUESDETECTIoNSupervisor：Prof．NingChangshenProf．ZhangGaipingMastercandidate：YangJifeiABSTRACT：Sulfadiazine(SD)isakindofsyntheticantibacterialmedicine，andWasusedwidelyinstockbreedingfieldduetothevirtuesofwiderange，lowercost，andconveniencetouse．It，simultaneously,threatshumanhealthbyresidueinanimal’Sbodyandtransferinanima-derivedfoodsbymeansoffoodcycle．MannydetectionassaysofSDresidueshavebeendevelopedsuchashighperformanceliquidchromatography(HPLC)，gaschromatography(GC)，HyphenatedMethod，CapillaryElectrophoresis(CE)andimmunochemistry．Theimmunologicalanalyticaltechnique，whichhasmanymeritsofsensitivity，specificity，rapidityandconvenience，hasbeengenerallyusedindeterminationofdrugresiduesinanimalfood．ThisstudyaimedatimmunologicalrapiddeterminationofSDresiduesinanimalfood，includingthesynthesisofSDartificialantigen，preparationandspecialpropertiesofSDmonoclonalantibody(SDmab)andreagentkits，thepreparationandqualityofimmunologicalgold-labeledstrip．BasisonanalysisofmolecularstructureandimmunogenicityofSD，thediazotizationWasusedtoconjugateSDtobovineserumalbumin(BSA)andobtainedartificialimmunoantigen(BSA—SD)，thecoatingantigenOVA-SDWasobtainedinthesameway．BSA-SDandOVA—SDWassynthesizedsuccessfullybyidentificationwithultravioletandSDS—PAGE，antiserumofBALB／cmiceimmunizedwitllBSA-SDhadbeenidentifiedbyindirectELISA．AfterimmunizedBALB／cmice证mBSA-SD，onehybridomalinesof685-E4谢thhigllaffinityandhighspecificityWasscreenedbycellfusion．SDmAbwasproducedbyintraperitoneallyinjectcelllineintoprostanesensitizedBALB／emice．ThemAbhadagoodsensitivitywitll50％inhibitiveconcentration(ICso)of1．155．g／LandO．8％cross—reactivity(CR)tosulfamerazine(SMI)andlittleorrioCRtoothercompoundsbycompetitiveEL...
