六。淀粉样变的诊断和分型进展李剑VIP免费

基于质谱蛋白质组学的淀粉样变分型方法李剑北京协和医院血液内科lijian@pumch.cn淀粉样变是一种机制尚不明的系统性疾病致淀粉样蛋白:具有反向平行的折叠二级结构伴侣蛋白共沉积SAP蛋白ApoE蛋白ApoA-IV蛋白靶器官损害沉积效应直接细胞毒作用疑诊淀粉样变的可能非糖尿病性肾病综合征非缺血性的向心性肥厚的心肌病不明原因肝大或者胆管酶增高周围或自主神经病变不可解释的面部或颈部瘀斑或出血巨舌如何诊断？病理学诊断组织活检中发现均质粉染物质刚果红染色阳性活检部位阳性率骨髓60%腹壁皮下脂肪70%唇腺50%舌体>80%受累器官(肾-肝-心)>90%识别刚果红:荧光vs偏振光类型前体物来源治疗AL轻链克隆性浆细胞化疗/ASCTAA血清致淀粉样变蛋白A肝脏原发病治疗SSA野生型甲状腺转运球蛋白肝脏对症处理ATTR突变型甲状腺转运球蛋白肝脏肝移植AFib纤维蛋白原链肝脏肝移植AApoA1载脂蛋白A1肝脏/小肠肝移植透析相关2微球蛋白-间断血滤淀粉样变的类型多样:刚果红染色阳性不够非AL型并不少见Mayo诊所的肾脏淀粉样变亚型分布情况,%英国注册登记研究AL型vs.M蛋白有M蛋白+是否就是AL型淀粉样变？AL型淀粉样变是否都要有M蛋白+？AL型淀粉样变绝大部分都有M蛋白N=133例AL型淀粉样变血免疫固定电泳(S-IFE)尿免疫固定电泳(U-IFE)血清游离轻链比(FLCR)至少1个阳性M蛋白+AL型心脏淀粉样变性n=143ATTR(57%)AL(43%)SPEP/IFE/U-IFE+n=76ALn=56ATTRn=20FLCR+n=61ALn=53ATTRn=8组织内淀粉样变蛋白的鉴定方法免疫组化法/免疫荧光法(IHC)免疫电镜荧光法已知突变基因的DNA测序质谱法新鲜组织全蛋白质谱激光显微切割+质谱假阴性率高316例AL型中只有121例有阳性组化结果商品化抗体种类少抗体质量影响蛋白构象变化导致抗体结合位点丧失假阳性率高-缺乏主导蛋白组织泛染，-均阳性标本处理过程中蛋白杂质污染免疫组化法不再推荐用于AL淀粉样变分型高通量分析直接显示全部蛋白构成，无需逐一检测各种致病性蛋白蛋白鉴定不受构象变化影响鉴定突变型蛋白不依赖于基因检测利于发现新的致病蛋白种类激光显微切割联合质谱蛋白质组学(LMD/MS)微量蛋白提取LMD/MS鉴定亚型有着高特异性和敏感性N部位敏感性特异性备注113神经100%100%部分为IHC分型失败病例241心脏98%100%IHC分型成功率为42%321神经100%NA均为IHC失败病例。10例ATTR的LMD/MS分型结果与基因检测完全相符4127肾脏96%NA大部分为IHC失败的病例；发现了新亚型ALect2福尔马林固定后的石蜡包埋组织回顾性分析会诊分析无需新鲜组织冻存显微切割准确定位出淀粉样变物质沉积区实现病变与正常组织的准确分离LMD/MS的方法学优化蛋白提取质谱前处理质谱结果分析最佳的蛋白提取液微滤膜使用微波处理加速流程emPAI定量蛋白P积分&D积分的设定1.5h2.5h2h最佳蛋白提取液的确定最佳蛋白提取液的确定:0.2%Zwittergent肽段数蛋白数谱图数≫𝟐种肽段的蛋白数总的蛋白丰度平均蛋白丰度质谱结果的解读:利用P积分确定是否为淀粉样变P-score(%)=Σ(emPAIamyloid)Σ(emPAItotal)×100Σ(emPAIamyloid)=致病蛋白emPAI+各种伴侣蛋白emPAIΣ(emPAItotal)=所有蛋白的emPAI总和测定20例确诊淀粉样变vs18例正常对照标本•P积分>=5.0:•诊断淀粉样变的敏感性100%;特异性83.3%质谱结果的解读:利用D积分确定是否为何种淀粉样变D-score=emPAI1st–emPAI2ndemPAI1stemPAI1st=丰度最高的致淀粉样变蛋白的emPAIemPAI2nd=丰度次高的致淀粉样变蛋白的emPAI阳性对照组的D积分=0.32~0.93•D积分>=0.3可以确定出丰度最高的致淀粉样变蛋白的致病蛋白PUMCH的LMD/MS研究2000年1月至2014年6月期间我院确诊的138例系统性淀粉样变患者有器官肿大和(或)器官功能不全的临床表现组织活检可见粉染无定形物质沉积，刚果红染色阳性P积分>=5.0&D积分>=0.3确定亚型分型组织类型(n=138)分型组织涉及各个脏器腹壁脂肪最为常见具体分型结果除了8例分型失败和4例分型不确定外总体诊断阳性率为91%轻链型淀粉样变最为常见发现了一些以往少见的淀粉样变性类型脂肪组织是最为...