PCR的原理和应用-2011VIP免费

PCR的原理和应用黄宝福枫岭生物雅睿生物fbhoyear@funglyn.com核酸1868年，FriederichMiesescher从脓细胞核中分离出一碱性蛋白和含磷的有机酸的混合物，称之为核素1928-1952年，证实遗传的物质基础是核酸核酸（nucleicacid)是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子核酸分类核酸核糖核酸（ribonucliecacid,RNA)：细胞质和细胞核内，参与细胞内DNA遗传信息的表达脱氧核糖核酸(deoxyribonucliecacid,DNA)：细胞核和线粒体内，携带和传递遗传信息，决定细胞和个体的基因型（genetype)病毒中，RNA也可作为遗传信息的载体DNARNA嘌呤碱腺嘌呤(A)腺嘌呤(A)（Purinebases）鸟嘌呤(G)鸟嘌呤(G)碱基Base嘧啶碱胞嘧啶(C)胞嘧啶(C)（Pyrimidinebases）胸腺嘧啶(T)尿嘧啶(U)戊糖(Pentose)D-2-脱氧核糖D-核糖酸(Acid)磷酸磷酸用酸将DNA/RNA完全水解DNA：含氮碱基、2-脱氧-D-核糖和磷酸RNA：含氮碱基、D-核糖和磷酸二.核酸的化学组成戊糖(pentose)核苷酸核苷磷酸(phosphate)碱基(base)核酸酶核酸DNA1.DNA分子由两条反向的平行多核苷酸链围绕同一中心轴构成的双螺旋结构。双螺旋表面形成大沟和小沟2.双螺旋直径2nm，碱基平面垂直于螺旋纵轴右手双螺旋模型要点3.4nm变性：DNA变性是指双螺旋的DNA分子双链解开形成单链的过程。由于双螺旋的稳定是靠碱基堆砌力及氢键来维持，所以DNA变性是不伴有共价键的断裂引起DNA变性的因素有：加热、化学因素（有机溶剂、酸、碱、尿素）和机械力ＤＮＡ分子的热变性ＤＮＡ双螺旋结构即遭破坏，氢键断裂，双链分离。将ＤＮＡ的稀盐溶液加热至80～95℃(或以上)数分钟，Tm：DNA热变性是在一很窄的温度范围内进行，这个温度范围的中点叫解链温度。用Tm值表示。它表示有50％的DNA分子解链时的温度增色效应：变性后的DNA分子溶液在260nm处的光吸收增加的现象DNA的变性在紫外吸收上的变化Tm的定义影响Tm的因素1.DNA的均一性越高,Tm的温度范围越小。2.G-C含量越高,Tm的值越大，当GC的含量上升1%，则Tm上升0.4℃。马默多蒂（Marmur-Doty）关系式：Tm=69.3+0.41(G+C)%，或GC%=（Tm-69.3）×2.443.介质的离子强度较高时,Tm的值较大。4.酸性条件下,核酸容易脱嘌呤,碱性条件下,核酸容易变性,通常加NaOH降低Tm的值。5.尿素,甲酰胺等化学试剂可以降低Tm的值,称作变性剂。复性：DNA变性后，当温度缓慢下降时，解开的双链可以重新締合形成双螺旋的过程，称之为DNA的复性DNA变性复性是否可逆以及可逆性的程度可人为加以控制核酸分子的杂交变性复性基于核酸变性和复性的原理，并依据碱基间互补配对的原则而建立的一门技术。主要用于确定两种相同或不同的核酸分子间同源性的鉴定聚合酶链式反应Polymerasechainreaction(PCR)1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…...很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，Mullis是其中之一Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，……Mullis的第一个PCR实验•1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶在37℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。PCR的发展史•1983年春，Mullis发展出PCR的概念；•1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；•1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49bp长度的第一个PCR片断；•1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；•1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），这回Mullis是第一发明人。•1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报...