大肠杆菌双杂交系统VIP免费

http://www.paper.edu.cn-1-大肠杆菌双杂交系统*闫健斌蔡伟康江雪源（南京大学医药生物技术国家重点实验室南京210093）E-mail:biosky@sohu.com摘要：大肠杆菌双杂交系统，作为一种新型的研究蛋白质相互作用的方法，近年来得到了快速的发展。本文详细介绍了该系统的特点、原理及发展现状等。关键词：双杂交，细菌，相互作用大肠杆菌双杂交系统是继酵母双杂交系统[1]和哺乳动物细胞双杂交系统[2]之后，产生的另一种直接于细胞内检测蛋白与蛋白相互作用的遗传学新方法。近几年来，该系统得到了飞速的发展，逐渐走向成熟并运用到了许多领域。1特点和优点虽然酵母双杂交系统近些年来得到广泛的应用和不断的改进。但其系统本身仍然还有一些局限。然而大肠杆菌双杂交系统，在某些方面则具有了更大的优势。第一、研究周期短，操作简单[3]。传统的酵母双杂交系统需要六天或更久才可得到结果，而大肠杆菌双杂交系统只需不到一天的时间。另外，使用大肠杆菌双杂交系统时，分离和扩增质粒都非常简单。第二，能够产生容量更大的文库。就目前的方法而言，酵母细胞的转化效率只能达到106cfu/μgDNA，而大肠杆菌细胞可达到109cfu/μgDNA。第三，更低的假阳性率和假阴性率[4]。大肠杆菌的遗传体系有更小的基因组复杂性，与高等真核生物相比，又具有更大的进化距离。从而，避免了在研究真核生物蛋白相互作用时，由酵母内源蛋白所引起的假阳性和假阴性现象。此外，一些真核的调控蛋白有可能对酵母细胞产生毒害，而同样的情况发生在大肠杆菌中的可能性会小得多。而且，采用大肠杆菌作为筛选宿主，还能够避免传统酵母双杂交系统对于核定位的要求。第四，更好的小分子药物筛选宿主。用酵母双杂交系统进行小分子药物的筛选时，一个关键的局限因素在于药物对于酵母细胞膜的可渗透性。然而，大肠杆菌细胞对于这些小分子药物的通透性要好得多[4]。2基本原理与酵母双杂交的原理相似。通过将所要研究的蛋白质分别与DNA结合域（DBD）与活化域（AD）融合，利用相互作用蛋白质提供的桥联功能，使活化域与DNA结合域结合，从而调控报告基因的表达。报告基因表达的调控结果可通过生化或遗传学的方法检测到。3建立*本课题得到国家自然科学基金资助（No.30470022）http://www.paper.edu.cn-2-大肠杆菌双杂交系统最初是由Karimova[5]等于1998年提出。该检测方法是根据百日咳博代杆菌（Bordetellapertussis）中的腺苷酸环化酶（CyaA）催化的反应为基础建立的。该腺苷酸环化酶催化cAMP的合成反应，其催化结构域可以分成T18和T25两个相对独立的功能单位。将所要研究的蛋白质分别与T18和T25片断融合后，再导入大肠杆菌DHP1(cya-)菌株中，如果待检蛋白质间能够相互作用，那么T18和T25片断就可借此结合到一起，催化形成cAMP。合成的cAMP作为一个信号分子，可激活作为报告基因的乳糖或麦芽糖操纵子的表达，产生可以识别的表型变化。4大肠杆菌双杂交系统的发展现状到目前为止，已经建立了许多不同体系的大肠杆菌双杂交系统。根据其建立原理可分为如下几类。4.1以λ阻遏蛋白为基础的检测系统[4]在λ噬菌体中，阻遏蛋白cI是以同型二聚体的形式发挥作用的。其每个亚基由两个功能不同的区组成，N端具有与操纵区结合的功能，C端则介导二聚体的形成。而且，一旦移除二聚体形成区就会明显降低DNA结合区与操纵区的结合力。所以，当用外源蛋白代替C端区域时，只有当其发生相互作用，才能恢复cI蛋白对DNA的结合能力。阳性克隆可通过对噬菌体感染的免疫力或报告基因得以检测。除了cI蛋白，大肠杆菌来源的转录抑制因子LexA，细菌的阿拉伯糖C基因编码的AraC等蛋白也已经用来构建这种系统。4.2以协同抑制为基础的检测系统当操纵子区域与启动子区域有重叠的时候，阻遏蛋白的结合就能影响大肠杆菌RNA聚合酶RNAP与启动子的结合，从而抑制转录。利用这一原理，将两个对DNA结合结构域DBD有不同亲和力的DNA位点串联起来，并使其中对DBD亲和力较低的序列与报告基因的启动子区域重叠，这样当与DBD融合表达的蛋白之间有相互作用发生，高亲和力DBD就可借此稳定低亲和力DBD与其识别序列的结合，从而阻碍RNAP的结合，抑制报告基因的表达。Hays和Hu[4]利用此...