动物医学进展.2007,28(4):53-57ProgressinVeterinaryMedicine哺乳动物肠上皮细胞的原代培养刘芳宁，张彦明’(西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨陵712100)摘要:肠上皮细胞是由多功能干细胞分化成的一个高度组织化系统。从离体的肠组织中分离的肠隐窝单位或肠上皮细胞可在数小时内保持高度活力，但要长期(达到10d)原代培养肠上皮细胞仍然很困难。文章对肠上皮细胞的分离、鉴定、原代培养所需维持培养基和生长培养基的设计及培养条件等方面进行了综述。关键词:原代培养;哺乳动物;小肠;结肠;上皮组织中图分类号:Q813.11文献标识码:A文章编号:1007-5038(2007)04-0053-05位于消化管内壁的肠上皮是一种单层组织，由肠隐窝基部的千细胞不断增殖。上皮细胞和成纤维细胞之间有紧密的联系，共同被称作内胚层结构增殖单位(endodermalstructural-poroliferativeunits)E'3。完整的内胚层结构增殖单位可以很好地通过细胞与细胞、细胞与细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)之间的相互作用或者信息分子的复杂信号网络来维持自身的平衡，但这个平衡系统在离体组织样品中是很脆弱的。因组织突然供血不良、温度调节失衡、细胞和细胞、细胞和ECM的相互作用也会紊乱。上皮细胞和ECM联系的紊乱会导致细胞程序化的死亡，即失巢凋亡现象(anoikis).肠干细胞对失巢凋亡有高度的敏感性，这也正是肠上皮细胞原代培养很难获得成功的主要原因。肠上皮细胞的原代培养物在生物技术和临床应用方面有很高的价值，涉及到食品、化妆品和药物毒力的检测，转基因种植和癌症治疗。要在原代培养时保持细胞原本的特征，必须设计组织培养的信号控制条件。但体外培养环境往往缺乏体内调节自我平衡所涉及到的系统成分，如神经和内分泌系统。而且原代培养时，分离的肠细胞中有许多异质成分，要将其培养成上皮细胞单层，培养条件往往很难确定。迄今为止，通过自发转化或永生化程序建立的肠细胞系在人工创造的体外环境中还不能产生具有活性的干细胞。为体内分化成熟的肠细胞人工创造一个完全正常的微环境也是不可能的，因为组织中的ECM和细胞结构在胚胎发育过程中已经死亡。目前人们在制备肠上皮单细胞、设计短期和长期肠上皮细胞培养系统方面已经已经取得了重要的进步。但要使原代培养的肠上皮细胞在体外存活10d仍然是很困难的。1肠上皮细胞的分离1.1组织移植和机械性分离组织移植法是分离肠上皮细胞最简单的方法。将肠组织剪碎，贴附在一定的培养基质上，细胞会从这些组织碎片移出，形成单层，但这些碎片一般要培养在用胶原蛋白包被好的生长基质上才有可能培养成功。在湿度培养箱中(37℃，体积分数为5%COO，分离的肠隐窝可以保持其组织结构4周。成年动物肠上皮在体外会迅速坏死退化，因此用成年动物肠组织碎片进行细胞培养很难获得成功，但成年动物肠上皮细胞的短期培养物对研究肠细胞的新陈代谢或ECM分子却很有价值。成年动物肠上皮细胞培养物在体外大多可存活12h-24h,Box-bergerHJ等(1997)将球状小囊样的正常人十二指肠三维立体(3D)培养物在体外已经成功地培养了30d。在体外培养过程中，隐窝细胞可产生一些细胞因子，如白细胞介素8，通过调整细胞培养基的成分，可用组织移植培养物来研究这些细胞因子在人类肠道发生炎症时的变化[2J0机械性分离法就是将肠戮膜层与戮膜下层剥离，机械性剪切后直接进行培养。但剪切组织是个很耗时的工作，不适合于自动化或规模化培养，与之相比，赘合作用或温和的酶消化作用在这方面有较大的优收稿日期:2006-12-19基金项目:国家自然科学基金项目(30471290)作者简介:刘芳宁(1973-)，女，陕西武功人，讲师，博士研究生，主要从事家畜传染病学研究。。通讯作者动物医学进展2007年第28卷第4期(总第163期)势。而且用机械性分离法培养肠上皮细胞时，经常存在成纤维细胞污染的问题。而用鳌合作用分离肠隐窝进行培养，成纤维细胞污染的现象很少。1.2荃合作用利用鳌合作用分离肠上皮细胞最常用的鳌合剂是乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)和二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT),EDTA可以赘合溶液中的Ca'和Mg2+，从而扰乱细胞之间的紧密连接，因而可以用来分离肠隐窝，并使隐窝中的上皮...
