斑点杂交步骤(2012)VIP免费

斑点杂交步骤待测DNA样本：人疱疹病毒1型DNA寡核苷酸探针：5-’GGCGACTTTGTGTACATGTTCCCGTTTTACGGCTACCGG-3’，5’端标记地高辛。斑点杂交步骤―D11.膜处理：将硝酸纤维素滤膜在双蒸水中充分浸泡，再于20×SSC中浸泡1h，夹在两层滤纸中37℃烘烤20-30min。2.变性：将待测DNA样品于100℃水浴10min，立即置冰中。3.点样：将上述变性后的样品各2μl点在已处理的硝酸纤维素膜的毛面上，室温干躁后，于烤箱中80℃烘烤1-2h。斑点杂交步骤―D24.预杂交：将杂交膜放入可加热封口的塑料袋中，加预杂交液100μl/cm2，尽可能赶尽袋中气泡，用封口器将袋口封住。置42℃恒温水浴摇床轻轻振摇30-60min。5.杂交液制备：用预杂交液将探针稀释为25ng/ml，即为杂交液，68℃水浴10min变性。6.杂交：取出杂交袋剪开一角，弃去预杂交液，加入预热至42℃的杂交液35μl/cm2。尽可能赶尽气泡，将塑料袋严密封口。置42℃恒温摇床上轻轻振摇过夜。斑点杂交步骤―D37.洗膜：剪开塑料袋，小心取出杂交膜，依次用2×SSC、1×SSC及0.5×SSC溶液，室温下漂洗各10min。8.封闭：小心取出杂交膜，在含有3-5mlWashingbuffer的平皿中平衡1-5min后，转入3-5mlBlockingbuffer中，37℃作用30min。斑点杂交步骤―D39.酶联抗体结合：将杂交膜封移入一个新的平皿中，加入抗体（抗体稀释方法：取1μlAnti-DIG-AP加入5mlBlockingbuffer中，轻轻混匀，4℃可保存12h），室温孵育30min，经常摇动，使酶联抗体充分与地高辛结合。10.洗膜：将膜放入含有3-5mlWashingbuffer的平皿中，洗膜2次，每次10-15min。再将膜移入含有3-5mlDetectionbuffer的平皿中平衡2-5min。斑点杂交步骤―D311.显色：（1）将40μlNBT/BCIP加入到2mlBlockingbuffer中。（显色液必须现配现用）（2）在新鲜制备的显色底物液中静止避光显色（不要摇动）。待膜上出现棕黄色斑点，而本底未显色时，用蒸馏水或TE终止反应。（通常在16h内完成显色反应）