变性梯度凝胶电泳（DGGE）的溶液配制、操作步骤及注意事项一、实验试剂及配置1、40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5：1）试剂用量丙烯酰胺38.93g双丙烯酰胺1.07gMilliQ（超纯水）水加到100mL溶液采用0.45µm滤膜过滤，储存在4℃2、0％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL20mL25mL30mL50×TAE缓冲液2mL2mL2mL2mLMilliQ水83mL78mL73mL68mL总容积100mL100mL100mL100mL3、100％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL20mL25mL30mL50×TAE缓冲液2mL2mL2mL2mL去离子甲酰胺40mL40mL40mL40mL尿素42g42g42g42gMilliQ水加到100mL加到100mL加到100mL加到100mL4、50×TAE缓冲液试剂用量终浓度Tris碱242.0g2M冰乙酸57.1ml1M0．5MEDTA，pH8.0100.0mL50mMMilliQ水加到1000.0mL将溶液混合溶解，121℃下蒸汽灭菌20-30min,储存在室温5、银染液的配制:原液：8×固定液（250ml）：乙醇200ml冰乙酸10mlMilliQ水40ml（A）：1×固定液（400ml）：8×固定液50mlMilliQ水350ml（B）银染溶液(400ml)：AgNO30.6gMilliQ水300ml（C）：显影剂（500ml）：NaOH4.5gMilliQ水300ml甲醛0.9ml6、10％过硫酸铵（APS）：过硫酸胺0.3g超纯水3.0ml溶解后使用0.45µm微孔滤膜过滤，4℃保存，保存时间为1周。7、10mlDGGE加样缓冲液：2％溴酚蓝0.25ml2％二甲苯青0.25ml100％甘油7mlMilliQ水2.5ml二、不同引物的变性梯度1,乳杆菌（380bp）变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵35％（12ml）7.8ml4.2ml13ul56ul65％（12ml）4.8ml7.2ml13ul56ul2,双歧杆菌（596bp）变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵40％（12ml）7.2ml4.8ml13ul56ul70％（12ml）3.6ml8.4ml13ul56ul3,肠球菌（300bp）变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵40％（12ml）7.2ml4.8ml13ul56ul55％（12ml）5.4ml6.6ml13ul56ul4,V3region（217bp）变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵35％（12ml）7.8ml4.2ml13ul56ul65％（12ml）4.2ml7.8ml13ul56ul60％(12ml)4.8ml7.2ml13ul56ul5,V6-V8region(489bp）变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵42％（12ml）7ml5ml13ul56ul58％（12ml）5ml7ml13ul56ul浓缩胶：0%变性储存液7ml，TEMED8ul，10%过硫酸铵36ul三、实验操作1．封槽（1）用95%乙醇擦净清洗一大，一小两块玻璃板，干燥。（2）用95%乙醇清洗两个间隔条，并将其置于大块玻璃板两侧边缘，外边缘与玻璃板边缘相齐。（3）将小块玻璃板置于间隔条上，对齐，并用夹子固定这个“sandwich”。2．胶的制备用不同体积的两种变性剂和丙烯酰胺贮存液配置变性剂要求浓度的胶。经验上讲，胶的体积以刚好覆盖胶板为宜。本实验V3区扩增产物DGGE采用65%和35%的变性剂浓度溶液；乳杆菌特异序列扩增产物DGGE采用60%和35%的变性剂浓度溶液。配置方法如下：不同引物的变性梯度0％100％总体积0%7mL0mL7mL35%7.8mL4.2mL12mL40%7.2mL4.8mL12mL50%6.0mL6.0mL12mL60%4.8mL7.2mL12mL65%4.2mL7.8mL12mL(1)清洗梯度合成器并使之干燥，并关掉两个槽之间的活栓。(2)干燥梯度合成器的槽。(3)分别向两个浓度的变性剂溶液中加4.5µL/mL10%APS(过硫酸铵)和1µL/mL的TEMED（四甲基乙二胺），搅拌均匀。(4)把高浓度变性剂溶液加到梯度合成器右边的槽中，低浓度变性剂溶液加到梯度合成器左边槽中。(5)将连接梯度合成器的出口针头置于胶板之间并固定。(6)推动梯度形成器形成的梯度分离胶即注入两层玻璃板之间。在混合和灌胶时应避免产生气泡。(7)分离胶灌完后，取出针头，将其置于一个锥形瓶中，并停止搅拌。(8)冲洗梯度合成器的两个槽，打开泵，排出其中水分。(9)在浓缩胶中加入10%APS和TEMED并将浓缩胶灌入两层的玻璃板之间。(10)待浓缩胶充满后，在其顶部插入梳子（避免产生气泡），放置1h。3．电泳(1)在电泳槽中添加新配置的电泳缓冲液，打开电泳仪预热到60℃。(2)取掉梳子，用蒸馏水清洗没有凝聚的胶,并将sandwich固定在电泳槽内。(3)调节缓冲液的高度，使其刚刚超过胶上的加样孔。(4)用缓冲液清洗加样孔（注射器及针头）。(5)向胶顶部的加样孔中加入PCR的产物。(6)盖上电泳仪...
