DifferexTM系统原英文技术手册号码：TBD020本说明书用于产品DC6800和DC6801。所有的技术文献均可从公司网站www.promega.com．得到请访问公司网站以证实您所使用的技术手册为最新版本I.介绍…………………………………………………………………………………II.产品组成…………………………………………………………………………III.从上皮细胞分离精子………………………………………………………………A.准备消化溶液………………………………………………………………B.差异抽提操作方法…………………………………………………………IV.问题及解决方法……………………………………………………………………V.参考文献……………………………………………………………………………VI.相关产品……………………………………………………………………………I介绍1985,Gill等(1)开发了在大量上皮细胞存在的情况下富集精子细胞的方法。在没有还原剂的情况下，上皮细胞经控制裂解后，通过离心从固体的基质分离完整的精子及含有来源于裂解的上皮细胞DNA的缓冲液。然后再通过离心沉淀精子及细胞碎片，除去含有上皮细胞DNA的溶液，但是由于沉淀的松散特性，依然会有含有上皮细胞DNA的溶液的残留。为了得到没有上皮细胞DNA的精子，需要多次洗涤及离心。尽管费时费力，这种处理方法在过去将近20年的时间里，也没有重大的改变。这种方法打破了除去上皮细胞DNA及洗涤过程中精子丢失之间的平衡。由于除去上皮细胞DNA及精子丢失之间的竞争特性，检验人员要花费大量的时间用以决定使用样品的量以及洗涤的次数，因此检验人员的经验水平在决定本分离方法的成功与否方面发挥了重要作用。Differex™系统使用标准的蛋白酶K消化并结合相分离与差速离心的方法来分离精子及上皮细胞DNA。经过标准的蛋白酶K消化后，将样品及缓冲液加入到含有非水，无毒，可生物降解的分离溶液的离心管中。这种溶液比水溶液的密度大，并且与水相缓冲液不互溶,但是比精子的密度小。13344667对未标于此处的问题，请与您当地的办事处或分公司联系。进一步的资料可登陆网页www.promega.com注意：本中文操作手册仅供实验参考，在使用中请详细对照原英文技术手册TBD020。如遇到问题请与普洛麦格（北京）生物技术有限公司联系，Tel：010-58256268，FAX：010-58256160，E-mail：chinatech@promega.com.cn技术手册号码：CTBD020第1页共7页在离心过程中，精子沉淀于离心管的底部。含有上皮细胞DNA的水相溶液位于非水相溶液的上方。借助于缓冲液的黄色，很容易将水相溶液除去。通常情况下只会残留一薄层水相。这种污染通过加入水对残留的DNA溶液进行稀释，很容易除去。水与底部的溶液不互溶，可以轻易地除去而无须多余的离心步骤。使用大密度的非水相溶液取代易被组织堵塞的膜，并且该溶液的非水相特性有助于精子紧紧地沉淀于底部并将细胞碎片与精子沉淀分开。当有效的除去含有上皮细胞DNA的溶液后，用DNAIQ™系统(Cat.#DC6701)分离精子DNA。将含有DTT的DNAIQ™裂解缓冲液加入沉淀中以溶解非水相溶液并裂解精子。然后加入DNAIQ™树脂，按照DNAIQ™纯化方法纯化精子DNA。对于上皮细胞DNA，用类似的方法进行纯化，即加入2倍体积的含有DTT的DNAIQ™裂解缓冲液及DNAIQ™树脂，然后按照DNAIQ™纯化方法进行纯化。图1所示从一个保存4年的拭子上分离的DNA为模板的扩增结果。从向样品中加入含有蛋白酶K的消化溶液开始，包括一个60分钟的蛋白酶K消化步骤，从上皮细胞中分离精子总耗时约为90分钟。DNA纯化需要30分钟,所以分离及纯化可以在2小时之内完成。也可以使用基于苯酚：氯仿的方法从分离的上皮细胞及精子中纯化DNA，但需要较长的时间。TheDifferex™系统提供了一种简单高效的用于除去含有上皮细胞DNA溶液的方法。可以减少操作者之间的误差。另外，因为只需离心一次，减少了操作过程中精子的损失。最后，标准方法中熟悉的蛋白酶K消化依然用于检材的前处理。图1.对从4年前的阴道拭子纯化的DNA的分析。使用Differex™系统从保存于室温4年的阴道拭子分离精子及上皮细胞。使用DNAIQ™系统从每一部分纯化DNA。用PowerPlex®16系统扩增DNA（上皮...
