tricine胶注意事项和要点VIP专享VIP免费

对于小分子量的蛋白：可以考虑一下Tricine-SDS-PAGE，即用三羟甲基甘氨酸（tricine）代替甘氨酸作为终止离子。Tricine-SDS-PAGE可以有效地分离1-100kDa的蛋白样品：下面推荐两个Tricine-SDS-PAGE电泳的protocol，供参考。推荐I首先是NatureProtocol上的一篇专门介绍Tricine-SDS-PAGE的文章，作者是该领域的专家——Schǎgger。NatureProtocols1,-16-22(2006)Publishedonline:12May2006|Correctedonline:10August2006|doi:10.1038/nprot.2006.4Tricine-SDS-PAGE要与小蛋白打很多交道的同志们可以仔细研读一下这篇文章，总结整理出适合你的具体方案。推荐II只是想看看Tricine胶的分离效果，偶尔一试，可以参考下面这个具体的protocol。Tricine胶的配方阴极、阳极缓冲液的配方介绍：常规的Tris-SDS-PAGE电泳的只能分辨大分子物质的，而对了相对分子量小的，尤其是10kD以下的蛋白分辨率极低。本人用Tris-SDS-PAGE做一个20KD以下的蛋白结果不是很理想，而且重现性差，因为在这种不连续的缓冲系统中，低分子量的常常堆积在浓缩胶中。而Tricine-SDS-PAGE可以很好的分离30KD以下的蛋白，而且本人还发现它同样对大蛋白也适用，我用它做过45KD，90KD，120KD左右的蛋白，而且每次上样3uL的Marker跑出来的10条带清清楚楚，几乎是平行的跑下来，常规的Tris-SDS-PAGE加了10uL的效果也没它好，有时越大下面越不清楚，也越窄。如果，有战友做小蛋白的话不妨试试看，下面是实验配方和步骤。一、缓冲液的配置：1.正极缓冲液anodebuffer（2X）：0.1MTris(pH8.9):12.114g加H20定容至500ml,4℃保存。2.负极缓冲液cathodebuffer(1X):0.1MTris+0.1MTricine+0.1%SDS不用调pH：6.057gTris+8.96gTricine+0.5gSDS加H20定容至500ml,4℃保存。3.凝胶缓冲液gelbuffer(G-B,3X):36.342gTris+0.3gSDS加H20定容至100mlH20,HCL调pH=8.45,过滤4℃保存。4.AB-3储存液(49.5%T,3%Cmixture):24g丙烯酰胺+0.75g甲叉双丙烯酰胺加H20定容至50ml,过滤4℃保存。5．AB-6储存液(49.5%T,6%Cmixture):23.25g丙烯酰胺+1.5g甲叉双丙烯酰胺加H20定容至50ml,过滤4℃保存。二、具体的步骤：1.按如下配方制备分离胶和积层胶：4%积层胶(3ml)10%分离胶(8ml)AB-3(mL)0.25--AB-6(mL)--1.63×gelbuffer(mL)0.752.67甘油(mL)--0.63H20(mL)23.110%APS(uL)22.540TEMED(uL)2.254先注入分离胶，待分离胶凝固后（0.5-1小时），注入积层胶。待积层胶凝固后（0.5-1小时）。2.上样电泳:总蛋白取25uL,细胞组分蛋白根据BCA定量后取75ug,加入6×SDS上样缓冲液煮沸5分钟，12000rpm离心2分钟，取上清进行蛋白电泳。准备电泳时，在电泳槽底部加入正极缓冲液，将制好的胶连同其装置放入电泳槽内，在两块胶之间注入负极缓冲液，用30V的电压预电泳10分钟，然后上样。当染料从积层胶进入分离胶后，电压加到90V,继续电泳直到溴酚蓝抵达分离胶底部，断开电源停止电泳。整个电泳过程在冰上或4℃进行。3．转膜和抗体孵育1）电泳近结束时，将裁好的与凝胶尺寸相当的PVDF膜先用甲醇浸透活化后，用去离子水漂洗，然后浸泡在转移缓冲液中。另外，裁剪六张尺寸一致的滤纸连同海绵垫一起置于转移缓冲液中浸泡。2）电泳结束后，小心取出凝胶，浸泡于转移缓冲液中，在转移缓冲液中安装转移装置，从负极到正极按如下顺序装置：海绵垫、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵垫。注意清除各层之间的气泡。转移装置放在搅拌器上并冰浴。连接好电源后，调整电压100V，湿转1-1.5小时。3）转膜结束后，用TBST缓冲液漂洗PVDF膜2次，每次5分钟，之后加入20mL封闭液完全浸泡膜，室温平摇2小时。4）根据预染Marker显示的分子量，在相应的范围内，将含有目的蛋白的区域剪下，放入预先准备好的含一抗的封闭液中，用塑料袋封好，4℃缓慢侧摇过夜。5）取出PVDF膜浸入TBST缓冲液，平摇洗膜三次，每次10分钟。6）在封闭液中按1：10000～20000比例加入辣根过氧化物酶标记的二抗，将膜置于其中，室温侧摇0.5-1小时。7）取出PVDF膜浸入TBST缓冲液，平摇洗膜四次，每次10分钟。4.化学发光显色：1）在暗室中，取等量的StablePeroxideSolution和Luminiol/EnhancerSolution混匀后，将PVDF膜浸泡其中，...