附录XIIB支原体检查法主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体，必要时，亦可采用指示细胞法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。第一法培养法推荐培养基及其处方（1）支原体肉汤培养基猪胃消化液500ml氯化钠2.5g牛肉浸液（1：2）500ml葡萄糖5.0g酵母浸粉5.0g酚红0.02gPH值7.6±0.2，于121℃灭菌15分钟（2）精氨酸支原体肉汤培养基猪胃消化液500ml氯化钠2.5g牛肉浸液（1：2）500ml葡萄糖1.0g酵母浸粉5.0g酚红0.02gL精氨酸2.0gPH值7.1±0.2，于121℃灭菌15分钟（3）支原体半流体培养基按液体培养基处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2.5~3g（4）支原体琼脂培养基按液体培养基处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂13.0~15.0g培养基灵敏度检查（变色单位实验法）(1)菌种肺炎支原体（ATCC15531）、口腔支原体（ATCC23714）,由国家药品检定机构分发。(2)操作将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36±1℃℃培养至培养基变色，盲传2代后，将培养物接种到待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7~10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3~10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种3支试管，置36±1℃℃培养7～14天观察培养基变色结果。(3)结果判定以接种后培养基管数的2/3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。液体培养基的灵敏度：肺炎支原体(ATCC15531株)应达到10-8，口腔支原体(ATCC23714株)应达到10-4。检查法（1）供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查者可贮存于2～8℃；超过24小时应置-20℃以下贮存。（2）检查支原体采用支原体液体培养基和支原体半流体培养基（或支原体琼脂培养基）。半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10～15分钟，冷却至56℃左右，然后加入灭能新生牛血清（培养基∶血清为82∶），并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。取每支装量为10ml的支原体液体培养基各4支、相应的支原体半流体培养基各2支(已冷至36±1),℃℃每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36±1℃℃培养21天。于接种后的第7天从4支支原体液体培养基中各取2支进行次代培养，每一支培养基分别转种相应的支原体半流体培养基及支原体液体培养基各2支，置36±1℃℃培养21天，每隔3天观察一次。（3）结果判定培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。【附注】质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度。第二法：指示细胞培养法（DNA染色法）将供试品接种于指示细胞（无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞）中培养后，用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体，在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。试剂(1)二苯甲酰胺荧光染料浓缩液称取二苯甲酰胺荧光染料5mg，加入100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank’s平衡液中，室温下用磁力搅拌器搅拌30~40分钟，使万全溶解，-20℃避光保存。(2)二苯甲酰胺荧光染料工作液无酚红和碳酸氢钠的Hank’s溶液100mL中加入二苯甲酰胺荧光染料浓缩液1mL，混匀。(3)固定液醋酸：甲醇（体积比1：3）混合溶液。(4)封片液量取0.1mol/L枸橼酸溶液22.2mL、0.2mol/L磷酸氢二钠溶液27.8ml、甘油50.0ml，混匀，调pH值至5.5。培养基及指示细胞(1)DMEM完全培养基。(2)DMEM无抗生素培养基。(3)指示细胞（已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞）取培养的Vero细胞经消化后，制成每1ml含105的细胞悬液，以每孔0.5ml接种6孔细胞培养板或其他容器，每孔再加无抗生素培养基3mL，于36±1℃℃、5%二氧化碳条件下培养过夜，备用。供试品处理(1)细胞培养物将供试品经无抗生素培养液至少传1代，然后取细胞已长满的且3天未换液的细胞培养上清液待检。(2)毒种悬液如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时，应用对支...
