凝胶层析法测定蛋白质分子质量VIP专享VIP免费

凝胶层析法测定蛋白质分子质量一、实验目的1.了解凝胶层析（GelChromatography）的原理及其应用。2.通过测定蛋白质分子质量的训练，初步掌握凝胶层析技术。二、实验原理凝胶层析又称凝胶排阻层析（GelExclusionChromatography），凝胶过滤（GelFiltration），渗透层析（GelPermeationChromatography）或分子筛层析（MolecularSieveChromatography）等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。凝胶层析技术被广泛应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等各种生物化学实验过程之中。测定蛋白质分子质量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。用凝胶来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近似于球形）具有不同的排阻效应实现的。即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关：Kav=（Ve-V0）/（Vt-V0）。在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子质量的变化而改变。分子质量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小则Ve值大，Kav值大。有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要的参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。在相同层析条件下，被分离物质Kav值差异越大，分离效果越好。反之，分离效果差或根本不能分开。在实际的实验中，我们可以实测出Vt、V0及Ve的值，从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，Kav和lgMr成线性关系：Kav=-blgMr+C其中b，C为常数。同样可以得Ve=-b’lgMr+C’,其中、为常数。可以通过在一凝胶柱中分离多种已知分子质量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线然后用同一凝胶柱测出其他未知蛋白的分子质量。三、实验仪器和实验试剂（一）器材1.玻璃层析柱。2.HL-1型恒流泵。3.BSE-100型自动部分收集器。4.8823B紫外检测仪。5.SPECORD-200紫外分光光度计。6.TYPE3057PortableRecorder记录仪。7.100ml试剂瓶。8.50ml、100ml量筒各一个。9.50ml、100ml、250ml、500ml烧杯各一个。10.10ml刻度试管。11.胶头滴管。12.玻璃棒。（二）试剂1.标准蛋白（1）牛血清白蛋白：Mr=67000（上海生化所）（2）鸡卵清清蛋白：Mr=45000（美国SIGMA公司）（3）胰凝乳蛋白酶原A：Mr=24000（4）溶菌酶：Mr=143002.未知蛋白样品（由实验室制备）3.洗脱液0.025mol/LKCL-0.1mol/LHAC4.蓝色葡聚糖-2000四、实验操作和具体过程（一）凝胶的溶胀称取7gSephadexG-75于250ml烧杯中加入洗脱液100ml，置于室温溶胀2~3天，反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去处凝胶孔隙中的空气，沸水浴中煮沸2~3小时（可去处颗粒内部的空气以及灭菌）。（二）装柱1.取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。2.凝胶柱总体积（Vt）的测定：在距离柱上端5cm处作一个记号，关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接受柱中去离子水（水面降至层析柱玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt。也可以最后走完未知蛋白后再测定Vt。3.在柱中加入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1cm~2cm高度后打开出水口，流速一般用5~6ml/10min。胶面上升到柱记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶...