第42讲基因工程及其安全性1.基因工程的诞生(Ⅰ)2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)3.基因工程的应用(Ⅱ)4．蛋白质工程(Ⅰ)5.实验：DNA的粗提取与鉴定基因工程的操作工具1．基因工程的概念理解(1)供体：提供目的基因。(2)操作环境：无菌。(3)操作水平：DNA分子水平。(4)原理：基因重组。(5)受体：表达目的基因。(6)本质：性状在受体生物体内表达。(7)优点：克服远缘杂交不亲和障碍，定向改造生物的遗传性状。2．DNA重组技术的基本工具(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。②作用：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。③结果：产生黏性末端或平末端。(2)DNA连接酶项目E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体功能连接黏性末端连接黏性末端和平末端结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键(3)载体①常用载体：质粒②其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。③具备的条件a．能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。b．有一个至多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。c．具有特殊的标记基因，以便进行筛选。④作用a．作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。b．利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。1．限制性核酸内切酶(限制酶)(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称。无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如，以中心线为轴，两侧碱基互补对称；=====以=====为轴，两侧碱基互补对称。(2)切割后末端的种类(3)限制酶的选择技巧①根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类a．应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。b．不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。c．为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。②根据质粒的特点确定限制酶的种类a．所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端。b．质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不只一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。2．限制酶和DNA连接酶的关系(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。(2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(3)DNA连接酶起作用时，不需要模板。3．载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：关于基因工程工具的几个易错点(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端或平末端。(4)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端或平末端。(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。(6)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。(7)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。1．(2016·高考全国卷乙，40)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大...
