实时荧光定量PCR技术原理、应用及实践(RealtimeQuantitativePCR)RealtimeQuantitativePCR精选主要内容Real-timeqPCR的定量原理2Real-timeqPCR的检测方法3Real-timeqPCR的基本概念1Real-timeqPCR的解析方法4精选PCR：基本原理Denaturation:94–96°CAnnealing:50–65°CExtension:70–75°C基本要素：•Template•Primers•DNApolymerase•dNTP,N=A,G,CorT精选PCR：基本原理•理想的PCR反应：N=N0*2n•实际的PCR反应：N=N0*(1+E)n•N0：初始模板量•N：第n次循环后的产物量•n：扩增反应的循环次数E：扩增效率S形曲线，具有平台效应精选与普通PCR的对比同一个样本进行96次重复传统PCR检测RealtimePCR检测RealtimePCR--起点检测：--起点量是样本中起始的DNA量--“加入了500个拷贝”--具有重现性，误差小传统PCR--终点检测：--终点产物量经过PCR放大的DNA量--“生成了500，0000，0000个拷贝”--不恒定，误差大传统PCR检测精选Real-timeqPCR激发光发射光--在PCR反应体系中加入荧光基团。--荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。--利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。荧光基团精选扩增曲线（primarycurve）扩增曲线：随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。纵坐标：Rn（荧光值）横坐标：cyclenumber（循环数）线性图对数图精选荧光阈值（threshold）基线(baseline)：一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信号荧光阀值(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值--缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍--手动设置：大于样本的荧光背景值精选Ct值(CycleThreshold)Ct值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，荧光值所对应的PCR循环次数。起始模板量基线阈值Ct值精选Ct值(CycleThreshold)Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动很大，但Ct值相对固定；Ct值则极具重现性精选Ct值可以确定初始模板量？Rn=RB+X0(1+E)N*RS第n个循环的总信号=本底信号+起始DNA数目*PCR扩增效率*单位信号强度当循环次数n=Ct时RCt=RB+X0(1+E)Ct*RS两边同时取对数得:lg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRSCt=-lgX0/lg(1+E)+lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E)Ct=-klgX0+blgX0与Ct值呈线性关系根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数起始拷贝数越多，Ct值越小。精选Rnvs.Cyclenumber--扩增曲线LogDNAvs.Ct--标准曲线.未知10410310610510210标准曲线(standardcurve)标准曲线分析--对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释精选y=-ax+b测定荧光定量PCR反应的有效性--线性的标准曲线：相关系数R2--扩增效率：扩增效率(E)=10-1/斜率-1标准曲线分析精选荧光定量PCR检测方法染料标记：SYBRGreenI探针标记：水解探针：TaqMan非水解探针：Molecularbeacon精选SYBRGreenI工作原理SYBRGreenI是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料。SYBRGreenI只与双链DNA结合才能发出荧光。荧光信号与双链DNA分子数成正比，随着扩增产物增加而增加。荧光信号强度与反应体系中所有双链DNA分子成正比。精选5’3’5’3’SGSGSGSG5’3’5’3’SGSGSGSGEmissionExcitation--变性时，DNA双链分开，无荧光信号。--延伸结束时，采集荧光信号。--变性时，DNA双链分开，无荧光信号。--延伸结束时，采集荧光信号。SYBRGreenI工作原理精选SYBRGreenI优点：使用方便，成本低--仅需设计两个引物通用性好--对DNA模板没有选择性需要在反应结束时，对产物做融解曲线分析。缺点：SYBRGreen与所有双链DNA结合--引物二聚体或错误扩增产物造成假阳性--只能检测单一模板，无法进行多重检测精选将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT)融解曲线(dissociationcurve)确认PCR反应产物的特异性对数图谱原始图谱精选融解曲线分析--非特异性产物--引物二聚体精选Taqman工作原理探针与靶序列配对（一段序列，两个基团，5’报告基团、3’淬灭基团）完整的探针，报告基团R发射的荧光被淬灭基团Q淬灭，没有荧光产生。聚合酶的5’外切酶活性报告基团R与淬灭...
