酶联免疫吸附(ELISA)实验具体步骤及详细说明VIP免费

酶联免疫吸附（ELISA）实验具体步骤及详细说明酶联免疫吸附（ELISA）可以：（1）免疫酶染色各种细胞内成份的定位。（2）研究抗酶抗体的合成。（3）显现微量的免疫沉淀反应。（4）定量检测体液中抗原或抗体成份。本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。我们用在霍舌L肠毒素的测定。HbSAg及HbS的测定。具体步骤一、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1~10ug/ml）,每凹孑L加0.3ml,4°C过夜，或37°C水浴3小时，贮存冰箱。二洗涤：移去包被液，凹孑L用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。三、每凹孑L加入0.2ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37C作用1~2小时。四、洗涤：移去包被液，凹孑L用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。五、加入0.2ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37工作用1~2小时或由预试实验确定作用时间。六、洗涤：移去包被液，凹孑L用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。七、加入0.2ml底物溶液于每个凹孔（OPD或OT），室温作用30分钟（另作一空白对照,0.4ml底物加0.1ml终止剂）。八、加终止剂：每凹孑L加2MH2SO4或2M柠檬酸0.05ml。九观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD用492nm）OD值。注意事项1•可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。2•包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。3•对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。4•用最适稀释度抗原，包被固相载体不仅经济，而且可以克服前带现象。可通过棋盘滴定法进行测定，但用单项滴定法更为简便，其方法是将抗原进行一系列稀释包被微量反应板，再用一定稀释度的阳性参考血清和阴性参考血清进行孵育后洗涤，再加酶结合物进行反应，经孵育洗涤后,加底物溶液显色,终止反应后分别测定OD值,选择OD值A1.0的那个抗原稀释度为最适包被浓度。—般总是要选择那个OD值稍大于1.0,而不选择小于1.0的抗原浓度。阴性参考血清OD值要求V0.1-0.2。也就是要求阳性参考血清和阴性参考血清的OD值有明显差别。5•抗原包被固相载体除浓度外，对时间、温度、PH均有关系。温度高（如37工、45工、或56工），包被时间可缩短，温度低可延长包被时间。但为了方便起见，通常采用4工包被过夜，可使抗原吸附得更加完全且均匀。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反应板或塑料管作固相载体时，在碱性条件下（如0.1mol/L、PH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原）4工包被过夜较为合适。但在某些试验中，如用LPS或毒素蛋白包被时，用PH7.2-7.4PBS稀释才是满意的。包被特异蛋白质的浓度为1-10ug/ml，而对某些病原微生物抗原以5-20ug/ml较为合适，但均应通过滴定。一、ELISA的影响因素1.固相载体可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。由于微量反应板所用试剂量少，操作方便，适合于大规模应用。国产聚苯乙烯微量反应板...