外泌体-未来医学研究和应用新方向VIP免费

Exosomes：Ourfuturetarget！简介•外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中•细胞主动分泌的囊泡样小体•大小较为均一，直径为40~100纳米•密度1.10~1.18g/ml•细胞外泌体携带多种蛋白质、mRNA、miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程•并有可能成为药物的天然载体，应用于临床治疗。•ThéryC是建立外泌体提取分离鉴定金标准的泰斗(Théryetal,2006)。•在Cell发表了一篇综述，文中着重讨论了EV对癌症转移作用的最新发现，下面就是她的综述内容Exosomes还是EV?•ThéryC提出应该是"exosomes“而不是”exosome”(Théry,etal.2014)•因为Exosome还含有另一个含义：外切酶体复合物，具有RNase活性。•分离的产物若没有进一步证明它的细胞内来源，应定义为混合的小EV——ExtracellularVesicles，即胞外囊泡。•来自多泡内体或MVB的才是exosomes，可检测囊泡是否含内体标志蛋白证明，如CD63。Multivesicularbodies，MVB=MVEMultivesicularendosomes•因此，这些exosomes的功能可能是广义EV的，也可能是真正的exosomes。•下面ThéryC的综述中使用广义的EV指没有专门鉴定过大小的囊泡，使用小EV指小于200nm的小囊泡。VEexosomes胞外其他囊泡（来自于其他个体或生物）EV帮助癌细胞长出“腿”？•1.肿瘤来源的EV对受体细胞有不同的作用。在原发性肿瘤位点，EV能稳定细胞突起，增强癌细胞运动能力。EV通过细胞外基质(ECM)局部沉积，促进定向的持续迁移，例如含有纤连蛋白(Fibronectin)的小EV。•2.包含金属蛋白酶(Metalloproteinases)的EV也可以直接参与ECM重构(Remodeling)，使特化的细胞突起具有降解能力，也就是侵入性伪足(Invadopodia)。ECM重构帮助肿瘤细胞在组织之间迁移。•3.EV可促进肿瘤基质细胞的分化或募集，如纤维母细胞(Fibroblasts)和骨髓来源细胞(Bonemarrow-derivedcells,BMDC)。反过来，周围纤维母细胞分泌的EV可以增强肿瘤细胞迁移能力及耐药性。•4.小EV还能进入循环，从原发肿瘤到达远端位点。小EV的堆积可能增加血管通透性，EV可以进入远端组织，诱导ECM重构、募集BMDC以及后来的肿瘤细胞，制造转移前微环境(Pre-metastaticniche)。体内分析EV转移的方法•将标签添加到分泌的EV里•I.将荧光蛋白基因融合到棕榈酰化(Palmitoylation)序列，标记全细胞膜，通过mRNA的新荧光我们可以跟踪结合或内化了EV的细胞•II.膜结合荧光素酶蛋白可以分析体内发光细胞，这样就能捕获结合EV的荧光素酶蛋白或荧光素酶mRNA•III.用CRE重组酶，检测EV内的mRNAEV帮助小RNA转运？•miRNA分泌进小EV，运输进靶细胞并发挥功能，直接调控miRNA靶标。Pegteletal,2010，发现小EV转运EB病毒miRNA到邻近未感染的细胞，抑制靶基因。•除了EV包裹的miRNA，miRNA起的作用也有可能是其他EV组分在靶细胞表达内源miRNA引起的。•如何明确上述两种情况？转运的miRNA是外源基因组编码的，如病毒的(Pegteletal,2010)或寄生虫的(Bucketal,2014)，又或者受体细胞是小鼠的，并没有所研究的miRNA(Alexanderetal,2015)。EV与免疫•最近报道发现肿瘤微环境中EV的RNA有着一段特殊的序列(Boelensetal,2014)：它带有5'-triphosphate末端，通过RIG-I感应器被受体细胞基质识别，诱导干扰素应答，跟病毒感染类似。这种应答也参与癌症细胞对放疗或化疗的应答。•小EV与包膜病毒有相似作用？何种表面分子协助受体细胞膜融合RNA或小分子内含物到细胞质呢？这个问题有待探索。外泌体分离和检测1.分离•到目前为止，仍没有一种提取方法能同时保证外泌体的含量、纯度以及生物活性。1.1离心法•最常用的方法。收集细胞培养液以后依次在300g、2000g、10000g离心去除细胞碎片和大分子蛋白质，最后100000g离心得到外泌体。•得到外泌体量多，纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体。1.2过滤离心•过滤离心是利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜离心分离外泌体。•截留相对分子质量是指能自由通过某种有孔材料的分子中最大分子的相对分子质量。•外泌体是一个囊状小体，相对分子质量大于一般蛋白质...