影响 PCR 的因素 [1] PCR 引物设计的原则 引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应(即错配)。 具体实现这 3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列 Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的 GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为 15-30 bp，常用的是 18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物 3’端出现 3 个以上的连续碱基，如 GGG 或 CCC，也会使错误引发机率增加[2]。 3. 引物 3’端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为 A 的错配效率明显高于其他 3 个碱基，因此应当避免在引物的 3’端使用碱基 A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对 PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。 4. 引物序列的 GC 含量一般为 40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大[2][5]。 5. 引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式 Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在 Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) [6][7]。 6. ∆G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用 3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而 5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的 3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应[6]。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，...
