分子生物学实验步骤总结超全VIP免费

一目的基因的获得细菌基因组DNA的提取（一）仪器1）台式高速离心机2）恒温水浴箱3）枪式移液器4）灭菌的EP管和Tip头（二）试剂1）溶液1:25%蔗糖50mmol/LTris-Hcl，pH8.050mmol/LEDTA，pH8.0500ug/ml溶菌酶（现用现配）100ug/mlRNase2)溶液Ⅱ：100mmol/LTris-Hcl，pH8.01%SDS400ug/ml蛋白酶K3）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）4）氯仿：异戊醇（24：1）5）3mol/LNaAc(pH5.2)6）异丙醇或无水乙醇7）70%乙醇8)TE缓冲液：10mmol/LTris-Hcl，pH8.01mmol/LEDTA，pH8.0(三)实验步骤1)5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。2）将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。3）加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。4）加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。5）向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。6）向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/LNaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。8）将DNA沉淀溶解于15ulTE缓冲液中，-20°C保存。9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。植物DNA的SDS提取法：（一）试验试剂：1）研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。2）10SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3）1SSC溶液：用10SSC溶液稀释10倍。4）0.1SSC溶液：用1SSC溶液稀释10倍。5）Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。6）氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。7）5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。8)SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。9)1mol／LHCl。10)0.2mol/LNaOH。11)二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。12)1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。13)0.05mol/LNaOH。14)DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol/LNaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。（二）实验步骤：1)称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。2)将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。3)离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。4)将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液［提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。5)再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。6)用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7)然后加入0.5ml左右的10SSC，使最终浓度为1SSC。8)重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。9)加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。10)加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集...