分子生物学实验项目三VIP免费

实验三植物基因组DNA的提取实验目的通过本实验学习从植物组织中提取DNA的方法。实验原理利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。仪器、材料与试剂（一）仪器1低温离心机2恒温水浴锅3台式离心机4琼脂糖凝胶电泳系统5微量加样器（二）材料与试剂1三羟甲基氨基甲烷（Tris）2乙二胺四乙酸（EDTA）3氯化钠（Nacl）4β-巯基乙醇5氯化钾（KCl）6异丙醇7乙醇8琼脂糖9十二烷基硫酸钠（SDS）1050mL离心管11陶瓷研钵12吸头、小指管13细胞提取液100mmol/LTris.HCl(PH8.0)15mmol/LEDTA(PH8.0)500mmol/LNacl1.25%SDS1mmol/Lβ-巯基乙醇145mol/LKCl15TE缓冲液10mmol/LTris.HCl(PH8.0)1mmol/LEDTA(PH8.0)16哥伦比亚野生型拟南芥（ArabidopsisColumbia）三周幼叶。17TIANGEN基因组DNA提取试剂盒（PlantGenomicDNAKit）（离心柱型）。实验步骤一、自配试剂提取步骤1取4g新鲜叶片，在液氮中充分研磨成粉末状（越细越好）。2将研磨好的粉末转移至50mL的离心管中，加入16mL细胞提取液，充分混匀，65℃水浴保温20min。3从水浴中取出离心管，加入5mL5mol/L的KCl溶液，混匀，冰浴20min。44000r/min离心20min。5降上清液转移到另一50mL的离心管中。6加等体积的酚/氯仿混匀，12000r/min离心5min，取上清。7加等体积氯仿，混匀，12000r/min离心5min，取上清。8加入0.6-1倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀。9离心获得沉淀，加70%乙醇洗涤3次，风干沉淀。10加入500μLTE缓冲液，溶解DNA。11取3mL上清液，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量。二植物基因组DNA提取试剂盒提取步骤1、拟南芥基因组DNA的提取以野生型拟南芥(ArabidopsisColumbia)2周幼叶为材料（称取叶片约100毫克），用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒（PlantGenomicDNAKit）（离心柱型）按以下步骤提取基因组DNA：21)取干净幼叶100mg，加入液氮充分研磨。2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴中20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。3)加入700μL氯仿，充分混匀，12000rpm(13,400хg)离心5分钟。4)小心的将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μL的缓冲液GP2，充分混匀。5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm(13,400хg)离心30秒，弃掉废液。（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心）。6)向吸附柱CB3中加入500μL去蛋白液GD（用前已加入无水乙醇），12000rpm(13,400хg)离心30秒，弃掉废液。7)向吸附柱CB3中加入700μL的漂洗液PW（用前已加入无水乙醇），12000rpm(13,400хg)离心30秒，弃掉废液。8)向吸附柱CB3中加入500μL的漂洗液PW，12000rpm(13,400хg)离心30秒，弃掉废液。9)将吸附柱CB3放回废液收集管中，12000rpm(13,400хg)离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CB3置于室温或50℃温箱放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL经65-70℃水浴预热的洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm(13,400хg)离心30秒，将DNA溶液收集到离心管中。11)离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12000rpm(13,400хg)离心2分钟。（注意：洗脱缓冲液的体积不应小于50μL，体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解）。2、实验结果提取得到的DNA应为一条带。3、实验结果分析1）DNA浓度及纯度检测3用紫外分光光度计在230nm、260nm、280nm和310nm上检测DNA样品的光吸收，通过吸收值计算DNA样品的浓度，并判断DNA样品的纯度。其中260nm的读数用来估计样品中DNA的浓度，OD260/OD280与OD260/OD230的值用于估计DNA的纯度，310nm为背景吸收值。1OD260=50μg/mL双链DNA或40μg/mL单链DNA。样品浓度（μg/mL）=[OD260-OD310]×稀释倍数×50对于DNA纯制品，其OD260/OD280≈1.8，OD260/OD230应大于2。OD260/OD280>1.8说...