分子生物学实验小技巧VIP免费

分子生物学实验小技巧主要内容1.SDS-PAGE2.双向电泳3.质粒提取4.WesternBlot5.溶液配制6.PCR、酶切、连接并进行凝胶检测7.RNA提取与检测8.其他SDS-PAGE1.????SDS-PAGE配制过程中，浓缩胶与分离胶可预先配好大体积（如100ml）预制胶，储存在4度冰箱（注：10%APS，TEMED不加），每次配置时只需吸取所需体积的预制胶加入相应体积APS，TEMED即可，预制胶可储存半年以上，能节省很多时间，更重要的是，可大大减少与丙稀酰胺的接触，减少中毒。。2.????配胶过程中，普通的SDS-PAGE中加入约13%的甘油，可以提高分辨率，有效防止小分子量蛋白的弥散。改进过程只需将配方中的水改成60%的甘油即可。。3.????胶配好后，若过夜使用，待凝聚后不要拔下梳子，把含胶玻璃板从制胶槽取下，注意玻璃板上下两边缘会有气体，所以需要加一点电泳缓冲液以避免胶内水分蒸发，用保鲜膜包上，然后放4度过夜，第二天在电泳槽内直接拔下梳子即可使用。4.????分离胶用水压胶不平时，可以换用乙醇（浓度无要求，干净即可），效果较好。5.????配置分离胶时因胶凝时收缩常导致加样孔变浅，可以将加剩的胶放入4℃以降低凝聚速度，而将凝胶放入37度促聚，并随时用4℃加剩的胶补充下降的胶面；另外将胶横放与水平面成10度角也可以减少收缩的影响。6.????丙烯酰胺放置时间过长（超过一年），会吸水潮解，导致胶不凝。。7.????凝胶时温度高凝胶快，但过高时，会影响交连物的孔径大小，25℃为宜。8.????氧气是胶凝固的终止剂，所以尽量避免胶中气泡出现。。9.????大肠表达检测时，一般要煮样，但煮出来时常较稠，用8M尿素重悬细胞后再煮效果较好。10.??配好的10×TBE经过高压灭菌后，不会形成沉淀，可以用很长时间，而且跑出的条带也很漂亮。11.??上样时，最后保证上样量一样，包括体积，当体积不同时，可以加缓冲液补全，这样跑出的胶较为一致。所有的加样孔都加样，可以防止边缘的样品拖尾，如样品不多，其余的孔均用上样缓冲液加满，防止影响条带扩散。12.??跑胶时，因为低电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形，所以低电压泳道会比高电压泳道跑的直一些，且分离效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分离。。13.??跑胶过程中，为节省时间，可以提高电压，但得注意散热，可以冰浴跑胶，将电泳槽放入盛有冰水的盆中，或是冰箱中，节省的时间的同时，效果也较好。。14.??防止条带跑歪：分离胶配好后4度过夜；在点样的时候紧靠于上样两边的点样孔各上20微上样缓冲液。15.??电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板，用流水冲玻璃板的缝隙处（也就是凝胶部分），一边冲一边轻轻掀起玻板，用水去充满玻板和胶之间的缝隙，很容易能把玻板掀开。接下来把玻板反过来，让胶面朝下，使其一端浸入到一个盛着水的大平皿中，轻轻晃动，胶很快就会被水带到平皿中了，丝毫不会损伤胶。。16.??染色时，为节省染色时间，可以先将染色液在微波炉内加热5-10秒，不能太久，避免冰醋酸挥发，然后在水平摇床上放置半个小时即可染色好。如果是旧染色液，隔十分钟加热一次。。17.??脱色时，可不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉中高火里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次即可。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液）。。18.??用硝酸银染色，那么显色时如果迟迟不出现条带，可以再显色夜里加一点甲醛。如果染色或显色没有做好，染成了海带胶，我们可以复染。将胶用一蒸水清洗7.8遍，再重新染色，显色。19.??脱色时用0.25MNaCl代替脱色液，效果较好，无毒。。20.??脱色时，在脱色液中加入娄张捏成条状的擦镜纸或是面巾纸，由于染料吸附到纸纤维上，可以加速脱色，待纸着色较深时，更换新纸条，不用换液。。双向电泳1.????向电泳玻璃板内加入胶条时，先在缝隙中加入配好的溴芬兰缓冲液，要加满，再将胶条贴后面玻璃板壁用薄塑料片将胶条缓缓推下至凝胶上缘，这样可以很好的避免胶条下形成空气泡。2.????一向电泳时，盐离子容易聚在胶槽的两侧，剪一小段IPG胶条放在两侧，构成盐桥，电压就容易上去了...