完整版细胞免疫荧光步骤VIP免费

1 细胞免疫荧光步骤【原理】 用特异性抗体（第一抗体）与细胞中的相应抗原反应，洗去未与抗原结合的抗体再用荧光标记的第二抗体与结合在抗原上第一抗体结合，形成抗原-抗体 -荧光抗体复合物由于荧光素在荧光显微镜下经过特定波长的光照摄激发后能发射出荧光，借此可对抗原定位和定量。【材料】 培养细胞【试剂】①4%的多聚甲醛。② PBS (0.18M PH≌7.2)：NaCl18 克， Na2HPO4. 12H2O 12 克， NaH2PO4,2H20 0.8 克溶于2000m 蒸馏水 。③ 封闭血清：与二抗同种来源属性的非免疫血清。 ④ 第一抗体 ：xxx。⑤ 第 二 抗 体 ： 与 一 抗 种 属 性 匹 配 TRITC 标 记 的 ，（ 中 杉 金 桥 公 司 ，ZF-0313 Goat Anti-Mouse IgG (H+L),）。⑥ DAPI ： （碧云天公司，Cat. C1006）染核。⑦ 抗荧光淬灭封片剂:碧云天公司Cat.PO126【器材】冰箱 ， 载玻片 ， 盖玻片（做正面标记） ，微量移液枪，移液枪枪头，吸管 ，湿盒 ，指甲油 ， DOCK笔 ，EP管 ，吸水纸，六孔 板 ， 摇床 ， 振荡器。【配制液体等】① 0.5%-Triton ： ( PBS99.5ml +0.5mlTriton由于 Triton比较粘，配前先在室温放会儿,磁力搅拌器搅匀可分装储存) ② 10% 正常封闭血清 ： ( 用 PBS-Triton 稀释 ，振荡器上振荡充分混匀，临用前配制)。③0.3%-Tween ；用 PBS稀释 Tween。【步骤】1 取出生长 48 小时的细胞爬片，移入一个干净的六孔板冷PBS浸泡不超过 3 分钟（事先在六孔板的第一排三个孔分别标记)。 2 每个玻片滴加4%的多聚甲醛冰上固定 14 分钟。 注意， 要水平，覆盖均匀。 （准备封闭血清用PBS-Triton 稀释1:10 振荡器上振荡混匀） 。 3冷 PBS,5分钟 X2 次 摇床 150rpm 缓慢洗净 ，PBS-Triton 透膜 5min 。（如果是胞浆，核或膜内表面表达需要这一步，如果是膜外表面表达的则不需要透膜）4擦干爬片边缘，用 DOCK笔 在爬片四周边沿画圈（以防止爬片上所加试剂因失去张力流失，导致干片）。将爬片分别放入六孔板下排与上排标记相对应的孔内（该加封闭血清了，此时要求板是干燥的，下一排板没用过是干燥的）。5用微量移液枪， 在每张爬片上加10% 正常封闭血清，室温湿盒中阻断30 min。（ 准备一抗，用PBS-Triton 稀释 抗体 1:100 振荡器上振荡混匀） 。6一抗孵育：加已经稀释好的一抗，用微量移液枪小心加一抗，（逐个片去封闭液，擦干圈外水，加一抗注...