回顾分子生物学的发展历程，PCR技术的发明和普及无疑是最重要的篇章之一。而 PCR技术在近 20年的不断发展创新中，最受瞩目当属荧光实时定量 PCR技术(real-time quantitative PCR, or qPCR)。定量 PCR技术真正实现了 PCR从定性到定量的飞跃，通过对 PCR过程的实时监控，专一、灵敏快速、可重复地精确定量起始模版浓度，已经在科研和临床诊断领域得到了越来越广泛的应用。本文从荧光定量PCR的原理入手，详细介绍荧光定量 PCR仪的类型和技术，为定量 PCR仪的选择提供详细参考。 一、背景 本来，PCR是为了将样本中微量的 DNA模版放大以便研究模版特性，随着研究的深入，要了解样本中基因的表达模式与疾病的关系，就需要了解标本中的 DNA原始拷贝数。理论上PCR过程中反应产物是以指数规模增长的，但实际的 PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是 S形曲线——因为随着PCR循环数的增加，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至 DNA模板等各种 PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率降低，产物生成的速度逐渐减缓，最终进入平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的 PCR反应体系进入平台期的时间和平台期的高低都有很大变化，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的 DNA拷贝数也往往不同。因此经过 PCR扩增的 DNA产物量不能反映起始模板量的真实情况。通过传统凝胶电泳 EB染色或者同位素标记只能定量 PCR的终产物量，而不能定量起始 DNA模版的拷贝数。 荧光实时定量 PCR技术是指在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。借助于荧光信号来检测 PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面可以在每次 PCR循环收集数据，建立实时扩增曲线，准确地确定域值循环数(CT值)，计算起始 DNA拷贝数，做到了真正意义上的 DNA定量。根据最终得到的数据不同，定量 PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。相对定量常见于比较两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。 荧光实时定量 PCR技术最早是在 1992年由一位日本人 Higuchi第一次报告提出的，他当时的初衷很简单，就是想实时地看到 PCR反应的整个过程，由于当时 EB（溴化乙锭）的广泛使用，最直接想到的标记染料就是 EB，可以插入到双链核酸中受激发光。这样，在普通 PCR仪的基础上再配备一个激发和检测的装...
