测序结果的判读 测序结果为.abi 格式，可用软件chrosmas 打开，一种颜色的峰代表一个碱基，峰的高低表信号的强弱。一个正常的N 表示机器没法判读是哪种碱基，原因是：杂峰的信号高于机器默认的值，机器会认为该处有两个峰，因此不能判断确定是哪个峰，需要人工判读。以下三种情况会出现 N：有杂合子，有杂峰，反应已结束。 原因：测序产物纯化不够 注意：染料峰位于序列的前 100 碱基以内;酒精峰位于序列的 220 ~ 320 碱基之间 产生的原因是样品或毛细管内有灰尘等固体小颗粒 原因：测序反应失败。 解决办法：改进条件，重做反应。注意两个关键因素：引物与模板之间的比例： 3.2 pmol: 200 ng。模板 DNA 的纯度和用量： 1.6 ~ 2.0 原因：残余的 Dye 太多，纯化不够。有测序反应，但效率低下信号太弱 解决办法：纯化充分。避开引物峰，确定新的分析起点 1、PCR 产物测序时出现重叠峰 问题图 1(模板中有碱基缺失，往往是单一位点(1-1)或两个位点(1-2)碱基缺失导致测序结果移码) 解决方法：将 PCR 产物克隆到质粒(如 T 载体)中挑单克隆测序，或将 PCR 产物进行 PAGE纯化(至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化)后再进行测序。 问题图 2(PCR 产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一) 解 决 方 法 ：主 要 原 因 是 PCR 产 物 没 有 纯 化 ，含 有 部 分 序 列 一 致 的 两 种 以 上 长 度 不 一 的 片 段 ，将 PCR 产 物 进 行 PAGE 纯 化 (至 少 琼 脂 糖 充 分 电 泳 后 切 胶 纯 化 )后 再 进 行 测 序 ， 便 可 解 决 。 问 题 图 3(测 序 引 物 有 碱 基 缺 失 ) 测 序 引 物 有 碱 基 缺 失 (一 般 是 引 物 的 5'端 缺 失 )， 和 模 板 的 碱 基 缺 失 即 图 1 有 些 类 似 ， 所 不 同的 是 模 板 碱 基 缺 失 一 般 是 在 一 段 正 常 测 序 序 列 后 才 出 现 移 码 ， 而 引 物 碱 基 缺 失 的 话 ， 则 从 测 序 一开 始 就 出 现 移 码 ， 表 面 在 图 形 上 便 是 一 开 始 就 是 严 重 的 峰 形 重 叠 。 解 决 方 法 ： 重 新 合 成 引 物 ， 或 将 引 物 进 行 PAGE 纯 化 2、克隆测 序 时出 现 峰 形 重 叠 原 因 ： 所 挑 选 的 重 ...
