CRISPRCas9技术解读VIP免费

CRISPR/Cas9系统及其应用IntroductionandApplicationsofCRISPR-Cas9forGenomeEngineeringAnliangDongApr.16th,2015pCRISPR-Cas系统简介pCRISPR-Cas系统的应用技术pCRISPR-Cas系统的应用前景contentsWhatistheCRISPR/Cas？uCRISPR/Cas----ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats/CRISPR-associatedproteinsuCRISPRlociØConsistofthesignatureCRISPRarrayandCRISPR-associated(Cas)genesØCRISPRarraylaseriesofrepeatsequences(directrepeats)interspacedbyvariablesequences(spacers)correspondingtosequenceswithinforeigngeneticelements(protospacers)lCRISPRarraysarefirsttranscribedasasingleRNAbeforesubsequentprocessingintoshorterCRISPRRNAs(crRNAs)thatisalsocalledsgRNA(shortguideRNA)ØCasgenes----CRISPR-associatedgeneswhicharetranslatedintoproteinsdirectrepeatsspacers1.CRISPR-Cas系统的研究历史1.1CRISPR-Cas系统的研究历史1987年，日本课题组在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002年，正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列2005年发现CRISPR的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过CRISPR系统可能以类似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遗传物质的入侵。2007年，Barrangou等首次发现细菌可能利用CRSPR系统抵抗噬菌体入侵；2008年，Marraffini等发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了CRISPR系统的功能2013年初，MIT的研究组首次利用CRISPR/Cas9系统对人293T细胞EMX1和PVALB基因以及小鼠Nero2A细胞Th基因实现了定点突变。同年Mali利用CRISPR/Cas9在人293T细胞和K652细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA修复机制高效介导外源基因定点插入。1.2CRISPR-Cas系统的结构CRISPR-CAS系统的组成主要包括:由不连续的重复序列R(repeat)与长度相似的间区序列S(spacers)间隔排列而成的CRISPR簇，前导序列L(leader)以及一系列CRISPR相关蛋白基因cas。Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guideRNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体就能发挥作用。uCRISPR/Cas----ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats/CRISPR-associatedproteinsuCRISPRlociØConsistofthesignatureCRISPRarray，CRISPR-associated(Cas)genesandØCRISPRarraylaseriesofrepeatsequences(directrepeats)interspacedbyvariablesequences(spacers)correspondingtosequenceswithinforeigngeneticelements(protospacers)lCRISPRarraysarefirsttranscribedasasingleRNAbeforesubsequentprocessingintoshorterCRISPRRNAs(crRNAs)thatisalsocalledsgRNA(shortguideRNA)ØCasgenes----CRISPR-associatedgeneswhicharetranslatedintoproteins1.3CRISPR-CAS系统的作用机理CRISPR的高度可变的间隔区的获得首先识别入侵的核酸和扫描外源DNA潜在的PAM（NGG序列），将临近PAM的序列作为候选protospacer；然后在CRISPR基因座的5'端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间1.3CRISPR-CAS系统的作用机理pCRIPSR基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)当该噬菌体再次入侵细菌时，CRISPR簇首先转录为长的crRNA前体，然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。pCRISPR/Cas系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰crRNA结合相关的Cas蛋白后，形成crRNA-Cas蛋白复合体，通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合，随后Cas蛋白对目标DNA进行断裂和降解。1.3CRISPR-CAS系统的作用机理2、CRISPR-Cas系统的应用2.1CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。通过修复途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造，即基因敲除，特异突变的引入和定...