MTT法原理步骤VIP免费

细胞的增殖检测（MTT法） MTT 法又称 MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济，但由于 MTT 经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。 一、检测原理 MTT 全称为 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（商品名：噻唑蓝），是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值（也有用 570nm 波长)，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。 二、试剂材料准备与实验仪器 1、对数生长期细胞 2、受试因素（药物） 3、5mg.mL-1MTT 溶液：称取MTT 0.5 克，溶于 100 ml 的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中（60℃水浴助溶），用 0.22μm 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放 4℃ 避光保存即可，在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。 （PBS 配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调 pH 7.4 ，定容 1L） 4、DMSO（二甲基亚砜） 5、96 孔板 6、酶联免疫检测仪 7、细胞培养箱 三、MTT法实验步骤 （一）普通 MTT法实验步骤 1、接种细胞：用含 10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔 1000-10000 个细胞接种到 96 孔板，每孔体积200ul. 2、培养细胞：同一般培养条件，培养3-5 天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3、呈色：培养3-5 天后，每孔加 MTT 溶液（5mg/ml 用 PBS 配制，pH=7.4)20ul.继续孵育 4 h， 终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。 每孔加150ul DMSO，脱色摇床振荡10min，使结晶物充分融解。 4、比色：选择490nm（570nm）波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 （二）药物MTT法实验步骤 1、贴壁细胞 （1）收集对数期细胞，调整细胞悬...