实验二十四 外周血单个核细胞的分离 （Separation of mononuclear cell in peripheral blood) 免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它涉及 T、B 淋巴细胞、NK 细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差别，借助这些差别可分辨不同的细胞类别.外周血单个核细胞（PBMC)的分离重要有两种办法，即聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法.市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll）和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为 1.077±0。001，单个核细胞涉及淋巴细胞和单核细胞，其密度为 1。050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为 1.080～1。110。将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底.【重要试剂和器材】1。聚蔗糖—泛影葡胺分层液 密度为 1。077±0。001。2.5g/L 台盼蓝。3.250U/ml 肝素溶液 用 Hank，s 液配制.4.Hank，s 液。5。注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。6。水平离心机、显微镜。【操作办法】1.抽取静脉血 2ml，注入含有 0.2ml 肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再加入等量 Hank,s 液混匀。2。取 2ml 分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上,形成清晰界面。稀释血液与分层液的容积比例以 2∶1～3∶1 为宜。3.置水平离心机中，r/min 离心 20min。4。离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞）。5。 用滴管直接吸出单个核细胞层,或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。6。加入 4 倍量以上的 Hank，s 液，充足混匀，1000r／min 离心 l0min。离心后倾弃上清液，再用 Hank,s 液洗 2 次.7。用含 10％～20％灭活小牛血清的 Hank，s 液或培养液配制细胞悬液。计数,并分别计数粒细胞和单个核细胞数,同时用台盼蓝检测细胞活力,最后按实验规定将细胞悬液调节到适宜浓度。【成果判断】 【注意事项】1。将血液进行稀释可减少血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量.2.温度变化可直接影响分层液的密度,即影响细胞的收获率和...
