常规PCR技术及几类PCR新技术的介绍VIP免费

常规 PCR 技术及几类 PCR 新技术的介绍 热启动 PCR 热启动 PCR 是除了好的引物设计之外，提高 PCR 特异性最重要的方法之一。尽管 Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在 72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行 PCR 反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如 site-directed突变、表达克隆或用于 DNA 工程的遗传元件的构建和操作，热启动 PCR 尤为有效。 限制 Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制 PCR 反应液，并将其置于预热的 PCR 仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。 热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA 合成，直到PCR 仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA 聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。 Platinum DNA 聚合酶对于自动热启动 PCR 来说方便高效。Platinum Taq DNA 聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA 聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA 聚合酶。此酶在常温下活性被封闭，要在 94℃－ 95℃下加热数分钟才能够恢复酶活性。同经化学修饰用于热启动的 Taq DNA 聚合酶相比，Platinum 酶不需要在 94℃延时保温（10 到15 分钟）以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA 聚合酶，在 94℃进行 2 分钟就可以恢复90％的 Taq DNA 聚合酶活性。 Touch-down PCR Touch-down PCR 又称降落PCR.即选定一个温度范围，如 50—35 ℃ ，每降1-2 ℃进行 1-2个循环，然后在 50 度下进行 15 个循环。 Touch-down 的原理 随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。 选择初始复性温度的原则 起始复性温度应该比引物的 Tm 值高出5-10 度，然后每个循环递减 1-2 度 Touch-down PCR 的应用范围 low copy of targeted DNA; high degree degeneracy (or less specific) ...