2025年HisTrap HP和HisTrap FF进行纯化中文操作指南VIP专享VIP免费

HisTrap HP 和 HisTrap FF 进行纯化中文操作指南HisTrap HP 和 HisTrap FF 是 1 毫升和 5 毫升的 HiTrap 柱子，分别预装了 Ni Sepharose High Performance 或 Ni Sepharose 6 Fast Flow 柱材。上样、洗涤、洗脱过程能够用带有配套适配器的注射器、蠕动泵或者如 ÄKTAdesign 同样的层析系统完毕（仪器选择请参见表 8）。HisTrap HP 和 HisTrap FF 的柱管由聚丙烯制成，含有生物兼容性并且不与生物分子发生互相作用。顶端和底端由多孔的聚乙烯烧结而成。柱子在运输时入口被塞子堵住，而出口被封死，但能够掰断。每个包装都含有全部用于把柱子连接到不同仪器上的必需配件。为快速放大纯化规模，两个或者三个 HisTrap 柱子（1 毫升或 5 毫升）能够串联使用（柱压会高些）。注意，HisTrap HP 和 HisTrap FF 柱不能打开或者再次填装。样品制备通用的样品制备过程请参考 26 页。通过加入缓冲液、氯化钠、咪唑和添加剂的浓储液，用结合缓冲液稀释样品，或者通过交换缓冲液等手段来调节样品适应结合缓冲液的构成和 pH 值。在样品和结合缓冲液中添加低浓度的咪唑对于避免有组氨酸暴露在外的宿主细胞蛋白结合在柱上是必要的（见第4 章）。在使用样品前一刻，将样品用 0.22 或 0.45μm 的滤膜过滤，并且（或者）离心。如果样品过于粘稠，为了避免堵塞柱子，需用结合缓冲液稀释样品、增加裂解操作（离心、匀浆）或加入 DNase/RNase 来减少核酸片断的大小。准备缓冲液结合缓冲液：20mM 磷酸钠，0.5M 氯化钠，20-40mM 咪唑，pH7.4 （最优的咪唑浓度是蛋白依赖的，20-40mM 适合于大多数蛋白）洗脱缓冲液：20mM 磷酸钠，0.5M 氯化钠，500mM 咪唑，pH7.4用于准备缓冲液的水和化学品应当是高纯的。用高纯的咪唑，这会在 280nm 处无紫外吸取或低吸取。纯化1. 将注射器或泵管用蒸馏水装满。移除塞子，把柱子连接到注射器（用提供的接头）、蠕动泵或层析系统上。保持连接处始终有液体避免向系统中引入气泡。2. 除掉柱子底部的密封。3. 用 3 到 5 倍柱体积的去离子水洗去乙醇。4. 用最少 5 个柱体积的结合缓冲液平衡柱子。建议流速是 1ml/min（1 毫升柱子）和5ml/min（5 毫升柱子）。5. 用注射器或者蠕动泵加入预解决的样品，为获得最佳的成果，在上样时，用 0.2-1ml/min（1 毫升柱子）和 0.5-5ml/min（5 毫升柱子）的流速。6. 用结合缓冲液洗涤最少 5 到 10 个柱体积，直到吸...