酶定向进化技术VIP免费

酶的定向进化技术的研究进展小组成员及分工查阅资料：周海军、王建伟做综述：徐晓川、李金龙做PPT:王小龙、王耀回答问题：许太彬、王建雄讲PPT：谢成卓、夏周全下面我们从一下几方面讲述酶的定向进化技术的研究进展1、什么是酶的定向进化技术？2、酶分子体外定向进化的方法3、酶定向进化的筛选策略4、酶的定向进化展示技术5、酶定向进化的研究意义6、应用7、酶的定向进化技术的展望酶的定向进化(invitrodirectedevolution)是在人工模拟自然进化过程的条件下，通过容错PCR、DNA改组、交错延伸技术、随机引物引导重组和递增截短技术等方法对编码酶的基因进行突变和体外重组，经高通量筛选获得性能更优良或全新的酶。定向进化是利用TaqDNA多聚酶不具有3’→5’校对功能的性质，并结合基因工程现有技术手段，在待进化酶基因的PCR扩增反应中，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，并构建突变库。凭借定向的选择方法，选出所需性质优化的酶，从而排除其他突变体。其基本规则是：“获取所筛选的突变体”。简言之，定向进化就是随机突变同选择或筛选相结合。与自然进化不同，定向进化是人为引发的，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。酶分子定向进化的目的在于：人为地改变天然生物催化剂的某些性质，增强在不良环境中的稳定性，创造天然生物催化剂所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性，产生新的催化能力，扩大生物催化剂的应用范围。酶分子体外定向进化的方法1易错PCR(Error-pronePCR)2DNAshuffling（改组）3Familyshuffling4交错延伸重组(StEP：Staggerextensionprocess)5随机引物体外重组(RPR：Random-priminginvitrorecombination)6临时模板随机嵌合生长(RACHITT：Randomchimeragenesisontransienttemplates)7非同源基因的重组(homology-independentgenerecombination)DNAshuffling又称为有性PCR(SexualPCR),其目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会,以导致更大的变异,最终获得具有最佳突变组合的酶。酶定向进化的筛选策略筛选方法在酶的定向进化中至关重要，直接关系到定向进化的成败。通常，采用的定向筛选方法必须灵敏，且应与目的性质相关。常用的筛选方法有常用的筛选方法有：利用底物显色反应，：利用底物显色反应，改变培养条件改变培养条件((如逐步提高培养温度或改变如逐步提高培养温度或改变培养基的培养基的pHpH等等););利用某些蛋白的固有性质，利用某些蛋白的固有性质，如产生绿色荧光或高通量筛选如产生绿色荧光或高通量筛选(HTS(HTS：：HigHighThroughoutScreening)hThroughoutScreening)，该技术可以根，该技术可以根据待测样品的合成路线分为液相和固相筛据待测样品的合成路线分为液相和固相筛选，也可以根据筛选目标物分为纯蛋白受选，也可以根据筛选目标物分为纯蛋白受体亲合性筛选，酶活性筛选，细胞活性筛体亲合性筛选，酶活性筛选，细胞活性筛选等。选等。HTSHTS现有的方法有：相筛选、使用放射性现有的方法有：相筛选、使用放射性染料筛选、荧光筛选、闪烁接近化验、染料筛选、荧光筛选、闪烁接近化验、ELIELISASA、利用细胞的功能筛选和利用小鼠显型、利用细胞的功能筛选和利用小鼠显型的表型遗传学筛选等等。的表型遗传学筛选等等。展示技术展示技术由于特别适用于高通量筛选，已经由于特别适用于高通量筛选，已经在药物筛选方面得到了广泛应用，而实际在药物筛选方面得到了广泛应用，而实际上它在改造酶方面也有巨大的应用空间。上它在改造酶方面也有巨大的应用空间。一、一、噬菌体展示技术噬菌体展示技术二、二、细胞表面展示技术细胞表面展示技术三、三、核糖体展示技术与核糖体展示技术与mRNAmRNA展示技术展示技术将编码外源肽或抗体的可变区DNA片段整合到噬菌体或噬菌粒的基因组中，以融合形式与噬菌体的表面蛋白共同表达于噬菌体表面，以利于配体的识别和结合。插入的DNA片段对噬菌体的生物学特性无大的影响，经过“吸附-洗脱-扩增”过程筛选，富集外源肽或特异性抗体，从而筛选出人们所需的...