免疫组织化学技术VIP免费

免疫组织化学技术杨晓青免疫组织化学免疫组织化学（IHC,又称免疫细胞化学)将显示剂（荧光素、酶等）标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体特异性反应和组织化学的显色反应，对相应抗原进行定位、定性及定量测定的一些技术常用方法：免疫酶标和免疫荧光等IHC的应用用于冰冻保存组织、福尔马林固定、石蜡包埋组织和各种方式得到的细胞(如穿刺、体液、涂片、血液分离和培养细胞等从理论上讲，任何一种物质只要其具有抗原性，或者与别的物质结合后具有抗原性，都可以用IHC方法在组织或细胞中加以证明免疫组化化学技术的特点原位性形态、代谢和功能结合定性、定位和定量三位一体酶免疫组织化学常用方法SP法（酶标链霉亲和素-生物素法，又称LSAB法）EnVisionEnVision法法（（抗原和非标记第一抗体结合后，再与标记有多聚葡聚糖-酶复合物的第二抗体结合）IHC－LSAB法免疫组化染色的基本步骤脱蜡预处理抗原修复处理染色检测复染免疫组化染色的基本步骤（SP法）1、石蜡切片脱蜡到水2、预处理：需要时选用3％过氧化氢溶液/3％过氧化氢甲醇溶液室温，10分钟3、抗原修复处理4、染色•PBS(PH7.2-7.6)5分钟，2次•正常血清(3%-10%)RT或37℃，20分钟•滴加第一抗体37℃,≥30分钟(或4℃，过夜)•PBS5分钟，2次•滴加第二抗体RT或37℃,≥30分钟•PBS5分钟，2次•滴加第三抗体RT或37℃，30分钟•PBS5分钟，2次5、检测酶作用底物：辣根过氧化物酶(HRP)－DAB、AEC碱性磷酸酶-NBT/BCIP6、复染苏木素1－2％甲基绿0.1%核固红7、脱水、透明、封片染色结果判断结果判断：细胞指数、阳性面积阳性模式：染色结果判断假阳性因素多克隆抗体与非待检抗原发生交叉反应组织对抗体的非特异性吸附内源性过氧化物酶和碱性磷酸酶的作用假阴性因素组织处理不当抗原被覆盖抗体质量不佳技术操作失误非特异性染色弥漫性、均一性着色组织边缘、胶原纤维、血浆渗出处、坏死组织、固定不良的组织中心随机分布的阳性反应产物点、块、团免疫组化染色的质量控制•选择恰当的组织固定方法和固定时间•严格的技术操作•对照：阳性对照不易检出的抗体阴性对照必要时选用空白对照新抗体预试自身对照经济实用组织准备和处理，抗原修复组织准备和处理，抗原修复组织处理取材：离体后30min内浸入固定液，动物标本要求在心脏跳动时取材不可反复切拉组织，避免挤压大小适中（1cm×1cm×0.2cm)固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片玻片处理：防脱片（多聚赖氨酸、3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)抗原修复原理：通过加热或酶消化的方法使经交联固定剂处理而形成的醛键打开，暴露抗原，从而免疫组化染色效果更佳。加热：10mM枸橼酸缓冲液pH6.0Tris-EDTApH9.0酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶抗体的分类多克隆和单克隆抗体多克隆抗体由纯化抗原注射免疫动物后提取动物血清纯化后制成。蛋白质抗原多含有多个不同的抗原决定簇，免疫动物后动物体内产生了许多针对不同的抗原决定簇的B细胞克隆，分泌的抗体是许多V区结构不同的抗体的混合物。抗体的分类单克隆抗体抗原免疫小鼠后，用小鼠脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞株在一定的条件下融合，形成具有长期存活并能分泌抗体的杂交瘤细胞，将其分离培养后可形成单个瘤细胞的克隆。培养上清或将杂交瘤细胞注入裸鼠腹腔产生的腹水中都含有瘤细胞分泌的Ig即为McAb。McAb是由一个瘤细胞及其后代产生的，它只针对一个抗原决定簇，所有的抗体分子在结构上是完全一致的。多克隆抗体和单克隆抗体的比较PcAbMcAb针对的抗原决定簇多个单一产生Ig的B细胞克隆多个单一特异性＋＋＋＋敏感性＋＋＋＋＋背景染色＋±与其它抗原的交叉反应＋－各批Ab之间的可重复性不一不变价格低较高抗体的购置商品化抗体最好购买DAKO、SIGMA、ZYMED、VICTORLAB等国际知名的公司的原装产品即用型抗体不需要稀释，可以直接使用，价格较低，对于研究生和基层病理科十分适用荧光免疫组织化学技术原理：利用抗原抗体特异性结合原理，将已知的抗体标记上荧光素，以此作为探针检测细胞和组织内的相应抗原，若抗原抗体结合，则在荧光显微镜下观察可见免疫复合物中的荧光素受激发光的照射后会...