酸性磷酸酶的分离纯化和动力学分析李平法临床生物化学教研室概述酶在物质代谢及调节中的重要意义；常用的酶蛋白分离纯化方法；酶类检测在临床生化检验中的意义；酸性磷酸酶作用特性及动力学特点。目的要求1.巩固诊断酶学有关的理论与实验知识；2.掌握酶的分离纯化方法；3.掌握酸性磷酸酶（aicdphosphataseACP）活性测定的原理、方法和影响因素；4.熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。试剂与器材一、ACP的分离纯化试剂：见实验教材P31；二、ACP动力学分析试剂：见实验教材P35；三、器材：普通离心机，721分光光度计，恒温水浴箱，研钵等。实验内容一、ACP的分离纯化二、ACP的比活性分析三、ACP的动力学分析1.时间进程（t-V）曲线2.酶浓度-速度（[E]-V）曲线3.pH-酶活性（pH-V）曲线4.底物浓度-速度（[S]-V）曲线5.抑制剂-速度（[I]-V）曲线一、ACP的分离纯化1.概况：ACP分布广泛分子量100kD最适pH5.0热稳定性较好溶解度较高临床应用广2.ACP的分离纯化方法♥根据ACP的理化性质，可以用层析、电泳、透析等多种方法分离纯化。♥本实验采用分级离心+分段盐析法：ACP与其它成分（细胞膜、杂蛋白）密度不同，以次逐步离心分离；ACP能溶解于水和低饱和度的硫酸铵溶液，在70ºC仍保持稳定，以此进行杂蛋白的变性沉淀和分段盐析。3.ACP分离纯化的步骤流程小麦胚芽100g+200ml冷蒸馏水滤液研碎，4层纱布过滤3500rpm，10min离心上清液I4000rpm，10min离心1mol/LMnCl22ml/100ml上清液I上清液II（激活并稳定ACP，沉淀杂蛋白）缓慢搅拌4000rpm，8min离心上清液5000rpm，10min离心饱和硫酸铵54ml/100ml上清液II上清液II（溶解ACP，沉淀杂蛋白）4000rpm，8min离心上清液III70ºC水浴2min冷水浴3min饱和硫酸铵51ml/100ml上清液II沉淀（酶粗提物）（沉淀ACP）缓慢搅拌缓慢搅拌4000rpm，10min离心约1/3上清液III蒸馏水，溶解，洗涤（溶解ACP，沉淀杂蛋白）4000rpm，10min离心上清液IV沉淀（酶粗提物）（沉淀ACP）EDTA9ml，饱和硫酸铵10ml/100ml上清液IV，2倍体积预冷甲醇沉淀（酶纯化物）4000rpm，10min离心蒸馏水溶解，洗涤上清液V（酶液）缓慢搅拌1.各上清液中蛋白质含量测定原理：染料结合比色法——CBBG-250，max=595nm；步骤：标准曲线制作各上清液中总蛋白测定（做平行管，进行重复实验，减少随机误差。二、ACP的比活性分析2.各上清液中ACP活性测定酚-4-AAP显色法:以磷酸苯二钠为底物，由ACP催化生成苯酚，在碱性条件下苯酚与4-AAP缩合最终生成红色醌类化合物，max=510nm；注意：显色过程中两种缓冲液：柠檬酸缓冲液：pH5.0，提供ACP反应条件碳酸盐缓冲液：pH10.0，提供成色反应条件3.各上清液中ACP比活性分析ACP活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生1nmol酚即nmol/min·ml为1个活性单位；纯化倍数=各上清液中ACP的比活性上清液I中ACP的比活性比活性=酶活性U/ml蛋白质含量mg/ml酶的回收率=各上清液中ACP的活性总体积上清液I中ACP的活性总体积还可以计算蛋白回收率，反映纯化效果，代表方法的特异性。三、ACP的动力学分析1.时间进程（t-A）曲线AACP的t-A曲线时间（t）酚生成量2.酶浓度-速度（[E]-A）曲线酶蛋白含量（E）反应速度VACP的[E]-V曲线3.pH-酶活性（pH-V）曲线pH反应速度V最适pHACP的pH-酶活性曲线1.影响方式：•当[S]较低时，V随[S]的增加呈正比例增加•当[S]较高时，V随[S]的增加减慢•当[S]增大到某一值时，V达到最大反应速度Vmax2.影响曲线：V[S]Vmax（矩形双曲线）Km4.底物浓度-速度（[S]-V）曲线曲线方程——米-曼氏方程（1）米-曼氏方程：V=Vmax[S]Km+[S]V：某一时刻的反应速度[S]：某一时刻的底物浓度Vmax：反应系统能够达到的最大反应速度Km：米氏常数Km和Vmax的测定：双倒数作图法：将米氏方程两边取倒数得111VVmax[S]Vmax=+1V1[S]纵截距=KmKmVmax斜率=Vmax1横截距=1Km-1.抑制剂的概念：抑制剂（inhibitor）：能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质2.抑制作用的分类：抑制作用不可逆性抑制可逆性抑制竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制5.抑制剂-速度（[I]-A）曲线竞争性抑制的动力学变化米-曼氏方程变化为：V=Vmax[S]Km（1+[I]/Ki）+[S]此时，Km增大，Vmax不变1/V1/[S]E+IEIKi无抑制剂有抑制剂KH2PO4对ACP的抑制分析1/V1/[S]无抑制剂有抑制剂分析抑制类型KH2PO4对ACP的抑制作用实验安排1.实验分组2.实验时间安排3.实验内容选择与分工4.实验报告书写谢谢指导
