纸层析法分离氨基酸剖析VIP免费

纸层析法分离氨基酸实验目的1、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术(包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。2、学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。实验原理层析法又叫色层分离法、色谱分析法或色谱法。1944年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来，层析技术的发展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也迅猛发展。层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既可用于实验室分离分析，又适用于工业生产中产品的分析制备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛应用而又必不可少的分析工具之一。分配层析分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配情况不同而使之得到分离的方法。分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相(固定相和流动相)间分配系数的不同。分配系数(K)的定义是：K=溶质在固定相的浓度(CS)/溶质在流动相的浓度(CL)二、纸层析(一)原理纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数，移动速度因此不同，从而达到分离的目的。溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示：Rf=X/Y式中X：溶质斑点中心的移动距离Y：溶剂前沿移动的距离Rf值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同，Rf值也不相同，由此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。(二)影响Rf值的主要因素1.物质的结构和极性物质的结构和分子极性是影响Rf值的主要因素。极性较大的物质，在水中的溶解度较大，其Rf值就较小，反之亦然。2.滤纸不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的水量不一样，两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不同型号的滤纸上进行层析时，所得到的Rf值也不相同。此外，滤纸上所含的杂质也会影响Rf值。3.层析所用的溶剂同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时，Rf值不同。所以溶剂的配制和使用必须严格，才能使Rf值的重现性好。在好的溶剂系统中被分离物质的Rf值应在0.05-0.85之间，样品中被分离组分的Rf之差最好大于0.05。溶剂系统中的试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使用。处理的方法因溶剂的性质而异。常用的处理方法有：酸、碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等4.pH值溶剂和样品的pH值会影响物质的解离，从而影响物质的极性和溶解度，使Rf值改变。溶剂的酸碱度增大则流动相的含水量增高，使极性物质的Rf值增加；反之则降低。为了避免或减少pH值对Rf值的影响，可将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理，使之保持一定的pH值。5.温度温度能影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用，即影响固定相的体积.所以温度的改变使Rf值变化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。6.展开方式同一物质在其他层析条件完全相同的情况下，用不同的展开方式进行层析时，所得到的Rf值不相同。用下行法展开时，Rf值较大；用上行法展开时，Rf值较小；用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf值也较小。7.样品溶液中杂质样品溶液中存在杂质时，有时对Rf值有所影响。例如：氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。(三)操作方法1.样品处理用作纸层析的样品，应尽可能除杂纯化。调节到一定的pH值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则需稀释。2.点样将滤纸裁成适当大小，用铅笔在距边线2cm左右划一直线(称为原线)，线上每隔2-3cm划一圆点(称为原点)。然后用点样器(定性分析可用普通毛细管，定量分析需用微量注射器)轻轻点在原点上。样品点的直径约0.3-0.5cm。点样的量应根据纸的长短以及样品的性质来决定，一般每一样品的量为5-30μg。点样一般采用少量多次，每点一次必须用冷风吹干，然后再点第二次。每次点样的位置应完全重合，否则会出现斑点畸形现象。3.平衡点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为“平衡”。若不经平衡，滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和，在层析过程中，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发...