2025年质粒载体基础VIP免费

第一节 质粒载体一、质粒的基本特性1．质粒的复制 普通一种质粒含有一种与对应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的构成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和 θ 复制。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一种来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。图 3-1 是其复制其始示意图。 在复制时，首先合成前 RNAⅡ ，即前引物，并与 DNA 形成杂交体；而后 RNase H 切割前 RNAⅡ ，使之成为成熟的 RNAⅡ ，并形成三叶草二级构造，该引物引导质粒的复制。形成的 RNAⅠ 可控制 RNAⅡ 形成二级构造，同时 Rop 增强 RNAⅠ 的作用，从而控制质粒的拷贝数。削弱 RNAⅠ 和 RNAⅡ 之间互相作用的突变，将增加带有 pMB1 或（ColE1）复制子的拷贝数。 图 3-1 带 pMB1（或 ColE1） 复制起点的质粒在复 制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。2．质粒的拷贝数 质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大概 1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。表 5-1 就是不同类的质粒与复制子及拷贝数的大致关系。 表 3-1 ：质粒载体及其拷贝数质粒 复制子 拷贝数 pBR322 及其衍生质粒 pMB1 15～20 pUC 系列质粒及其衍生质粒 突变的 pMB1 500～700 pACYC 及其衍生质粒 p15A10～212pSC101 及其衍生质粒pSC101 ～5 ColE1ColE115～20 pUC 系列质粒的复制单位来自质粒 pMB1 ，但其拷贝数较高。 pMB1 质粒的复制并不需要质粒编码的功效蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA 聚合酶 Ⅰ ，DNA 聚合酶 Ⅲ），依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶，以及宿主基因 dnaB 、 dnaC 、 dnaD 和 danZ 的产物。因此，存在克制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时，带有 pMB1（或 ColE1） 复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可积聚 2～3 千个质粒。3．质粒的不相容性 两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒普通都运用同一复制系统，从而造成不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一种细胞中复制时，在分派到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差别最后被放大，从而造成在子细胞中只含有其中一种质粒。而不相容群指那些含有不...