Westernblot步骤实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳转膜及显色过程VIP免费

Western blot 实验 蛋白提取及定量、相关试剂配制、 电泳、转膜及显色过程步骤 高征 2014 年 6 月 第一部分 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程 (碧云天试剂盒) 一、原理 在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称 gel shift)，footprinting 等。 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nu clear and Cy toplasmic Protein Ex traction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。约 90 分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。抽提得到的蛋白可以用于 Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。 本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂 A 和 B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒可以抽提50 个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约 30-50 毫克组织。 二、注意事项 1. 需自备PMSF。PMSF 一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3 分钟内加入，以免PMSF 在水溶液中很快失效。 2. 抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或 4℃进行。 3. 本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。可以抽提的组织样品数通常不足 100 个。 4. 使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产的 BCA 蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。但不适合用 Bradford 法测定蛋白浓度。 5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 三、使用说明 1 . 准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂 A 备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使 PMSF的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使 PMSF 的最终浓度为1mM。（蛋白酶抑制剂可酌情翻倍） 2. 对于贴壁细胞：用 PBS 洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用 EDTA 溶液（0.5%处理5min）处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心（1400 r/min 5min）...