医学生物化学基本实验 第一节 蛋白定量分析实验 蛋白质是一切活细胞和有机体的最重要组成成分，它是构成人体及所有动物机体组织的主要部分。蛋白质是由二十种氨基酸以肽键相互连接而成的复杂的高分子化合物。蛋白质含量可通过它们的物理化学性质，如折射率﹑比重﹑紫外吸收﹑染色等测定而得知，或用化学方法，如微量凯氏定氮﹑folin-酚试剂、双缩脲反应等方法来测定，表2-1 为五种蛋白质的测定方法的比较。 表 五种蛋白质测定方法比较 方 法 灵敏度 原 理 干扰物质 凯氏定氮法 (Kjedahl 法) 0.2～1.0mg 将蛋白质转化为氮，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 双缩脲法 (Biuret 法) 1～20mg 多肽键加碱性铜离子生成紫色络合物 硫酸铵；Tris 缓冲液；某些氨基酸 Folin-酚试剂法 (Lowry法) 5µg 磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr 和Phe 还原 硫酸铵；Tris 缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 考马斯亮蓝法 (Bradford 法) 1～5µg 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时其λmax 由465nm 变为 595nm 强 碱 性缓 冲 液 ；TritonX-100； SDS 紫外吸收法 50～100µg 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在 280nm处的光吸收 各种嘌呤和嘧啶；各种核苷酸 实验一 双缩脲法测定蛋白质含量 【实验目的】 掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。 【实验原理】 蛋白质分子中含有许多肽键，与双缩脲结构类似，在碱性溶液中能与铜离子结合成紫色的化合物（称双缩脲反应）。在一定浓度范围，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的含量。含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应。 【实验内容与方法】 1. 标准曲线的制作 (1) 取小试管 7 支，编号，按表 2-2 操作 表 2 -2 双缩脲法操作步骤 试剂（ml） 管 号 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白质溶液 生理盐水 双缩脲试剂 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 — 样品0.1 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 1.0 0.9 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 (2) 混匀后，于37℃水浴中保温 15min，在 540nm 波长下比色，以第 6 管调零点，测得各管的吸光度值。以各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质的克数为横坐标，绘成曲线。 2. 样品测定 取血清（或其它蛋白质溶液）0.1ml，加生理盐水0.9ml，再加二缩脲试剂4ml，于37℃水浴中放置 15min，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线即得出每 l00ml 血清（样品）中蛋白...
