微量DNA残留检测技术DNA残留检测的原理DNA残留检测技术由两部分组成：1.磁珠法提取微量DNA技术2.qPCR检测技术磁珠法提取微量DNA技术理论上，存在生物制品中的DNA属于微量杂质，可能传递肿瘤或病毒相关基因，并导致癌变或其他病理变化。因此，宿主细胞DNA残留量的控制是生物制品质量控制中非常重要的环节。原理：磁珠法提取DNA:这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。磁珠法中的细胞裂解液是一种蛋白变性剂，可使动植物的细胞裂解，并使与DNA结合的蛋白质变性，DNA游离释放，磁珠可以特异地吸附DNA，通过洗涤，去除DNA以外的蛋白质、多糖等杂质，再用洗脱液解离吸附在磁珠上的DNA。磁珠法抽提DNA过程：样品消化DNA结合DNA洗涤DNA洗脱蛋白酶K的作用：使与DNA结合的蛋白质降解,使DNA充分游离，促进DNA的分离。磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。首先要明白70%乙醇的目的一是去除残留的有机溶剂如异丙醇另一方面是去除盐离子及这个浓度对沉淀DNA效果最好。70℃水浴不少于10min提高洗脱效率使其提高回收率DNA残留提取过程定量PCR技术原理实时定量PCR是一种快速的高通量的检测方法，它是基于PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，产物的增加可以通过荧光信号指示，通过实时监控PCR体系中的荧光信号，对样本中初始模板进行定量分析。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。CT值：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）。为什么要检测残余DNA？绝大部分生物制剂是不经过胃肠道直接进入体内，所以除了生物活性外，监管部门对药品中杂质的限量要求非常严格。其中，宿主细胞残留DNA因为具有特别的潜在安全风险，一直是国内外药品监管机构关注的重点。先要了解它的来源和潜在危害性。来源：生物制品中的重组蛋白药、抗体药、疫苗等产品是用连续传代的动物细胞株(Vero，CHO)表达生产，则产生的生物制品含有特定的杂质，虽然经过严格的纯化工艺，但产品中仍有可能残余宿主细胞的DNA片段。对人可能产生的危害1.残留外源DNA可能造成插入突变，导致癌基因失活，癌基因被激活等，最终造成使用者致癌。2.残余DNA可能带来传染性。生物制品中宿主残余DNA既是是生产中带来的杂质，还存在一定安全隐患。因此，WHO和各国药物注册监管机构一般只允许生物制剂中存在100pg/剂量以下的残留DNA。根据杂质来源和工艺，特殊情况下最高允许10ng/剂量。我国生物制品中残余DNA检测标准与技术我国参照WHO、FDA和欧盟的标准，很早以前开始就对生物制品中残余DNA的含量进行限制。酵母、大肠杆菌表达的生物制品限定不超过10ng/剂，CHO和vero细胞表达的生物制品（EPO、狂犬疫苗、乙肝疫苗）等不超过100或10pg/剂。2015年底USP将只收录高灵敏度、高特异性的qPCR法作为残留DNA检测的推荐方法。收录：根据待测DNA的物种，合成以下基因序列。E.coli:Forwardprimer5’CCTTACGACCAGGGCTACACA3’Reverseprimer5’CTCGCGAGGTCGCTTCTC3’Probe5’CGTGCTACAATGGCGCATACA3’CHO:Forwardprimer5’CCTGAGTTCAATTCCCAGCAA3’Reverseprimer5’ACATTCTGCTTCCATGTATATCTGCA3’Probe5’TGGCTCACAACCATCCGTTATGAGACCT3’操作的合格标准任何可检出样品浓度必须落在标准曲线范围内。灵敏度：标准曲线最低浓度（标曲最低点）的CT值不大于39线性：标准曲线回归系数不低于0.98，斜率在-3.1~-3.8之间准确度：三个重复阳性对照样品均值回收率在50%~150%之间。中检院和中科院湖州营养中心的联合研发项目还将陆续推出Yeast和vero细胞残余DNA检测试剂盒，为国内生物制药产业的发展、为监管部门制订国家标准提供技术支持。谢谢！
