仪器分析实验课蛋白提取与测定VIP免费

主讲人：赵钜阳¨实验二：肌原纤维蛋白的提取¨蛋白质的沉淀。¨在水溶液中，可溶性蛋白质分子表面结合大量的水分子，形成水化膜。同时蛋白质分子本身带有电荷，与溶液的反离子作用，形成双电层，因而每个蛋向质分子可形成一个稳定的胶粒。整个蛋白质溶液就形成稳定的亲水溶胶体系。但这种稳定性是有条件的，相对的。当某些物理化学因素导致蛋白质分子失去水化膜或失去电荷，甚至变性时，它就丧失了稳定因素。以固态形式从溶液中析出，这就是蛋白质的沉淀反应实验二：肌原纤维蛋白的提取——原理肌原纤维蛋白的提取——原理实验二：肌原纤维蛋白的提取¨取猪背最长肌，剔除脂肪和结缔组织，切成1cm3小块，加入4倍体积缓冲液(10mMNa3PO4、0.1MNaCl、2mMMgCl2和1mMEGTA，pH7.0)，匀浆60s，3500r/min冷冻离心15min，取沉淀重复上面步骤两次，得到粗提的肌原纤维蛋白。然后取此沉淀加入4倍体积的0.1MNaCl溶液，匀浆60s，3500r/min冷冻离心15min，重复此操作一遍，取沉淀加4倍体积的0.1MNaCl溶液，匀浆60s，4层纱布过滤，取上清液，用0.1M的HCl调节pH值至6.0，3500r/min冷冻离心15min，沉淀即为提纯的肌原纤维蛋白，4°C冷藏备用。¨材料准备：猪背部最长肌、鱼背部最长肌¨试剂准备：¨提取液：(10mMNa3PO4、0.1MNaCl、2mMMgCl2和1mMEGTA，pH7.0)¨洗液：0.1MNaCl¨HCl：0.1MHCl¨实验三：双缩脲法测定蛋白质的含量双缩脲法测定蛋白质的含量——原理双缩脲法测定蛋白质的含量——原理1、标准曲线的制作(10mg/ml)BSA/mL00.20.40.60.81.0H2O/mL1.00.80.60.40.20双缩脲试剂/mL4.04.04.04.04.04.0静置30min后，在595nm波长下测吸光度以牛血清蛋白含量(µg)为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。采用双缩脲法测定蛋白浓度，牛血清蛋白（BSA）作为标准蛋白。实验三：双缩脲法测定蛋白质的含量标准曲线法¨标准曲线法的计算公式在一定条件下，标准曲线是一条直线，直线的斜率和截距可以用最小二乘法求得。工作曲线可以用一元线性方程表示：y=ax+b¨式中，x为标准溶液的浓度，y为相应的吸光度。使用最小二乘法确定的直线称为回归线，a,b称为回归系数。a为直线的斜率2、测定样品的蛋白含量取0.1mL蛋白质溶液，0.9mL蒸馏水，5mL双缩脲试剂充分混合，放置30min后，以标准曲线1号试管作参比，在595nm波长下测吸光度，记录。实验三：双缩脲法测定蛋白质的含量¨材料准备：待测蛋白¨试剂准备：¨双缩脲试剂：¨准确称取CuSO45H2O1.5g，酒石酸钾钠6g，溶解于200mL去离子水中，边搅拌边加入10%NaOH溶液300ml，去离子水定容到1000mL。此试剂可长期保存，配好后贮于塑料瓶中，若试剂中出现黑色沉淀则需重配。¨牛血清标准蛋白溶液：10mg/ml