实验（三）植物凝集素对红细胞的凝集反应与细胞膜的渗透性一、实验目的（1）了解细胞发生凝集反应的原理；（2）了解凝集素的生物学功能；（3）了解溶血现象及其发生机制。（4）了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。二、实验原理1.植物凝集素最早发现于1888年，Stillmark在蓖麻籽萃取物中发现了一种细胞凝集因子，它具有凝集红细胞、淋巴细胞、纤维细胞等作用。2.凝集素（lectin）是一类具有特异糖结合活性的蛋白，具有一个或多个可以与单糖或寡糖特异可逆结合的非催化结构域，能识别糖蛋白和糖脂中，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的糖基。3.一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力，通过与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”，从而使多个细胞聚集成团块状，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞发生凝集。植物凝集素4.目前已发现近千种植物中含有凝集素，在各种真菌、无脊椎动物、脊椎动物，人体的各种组织和器官中及某些病毒体内也含有凝集素。例如植物凝集素（phytohemagglutinin,PNA）、伴刀豆凝集素A（concanavalin,ConA）、麦胚凝集素（wheatgermagglutinin,WGA）等。5.植物凝集素可以识别并结合入侵者的糖结构域，从而干扰入侵者对植物产生的可能影响，参与植物的防御反应。6.植物凝集素的糖结合活性是针对外源寡糖，例如结合几丁质植物凝集素识别真菌细胞壁中的碳水化合物。二、实验原理二、实验原理7.人们利用凝集素与不同的糖蛋白特异性结合的原理，识别和研究不同类型膜结构的生物学特征，以及进行血型鉴定。ABO血型鉴定主要用于临床输血；器官移植的时候选择ABO血型相符的供体；新生儿溶血病因的分析等；8.凝集素在临床疾病防治、机体生理活动调控以及生物工程等方面的应用：芸豆凝集素可直接抑制HIV-1反转录酶活性；凝集素芯片技术实现对癌症的快速、高通量检测等。9.凝集素不是来源或参与免疫反应的产物，Ponder(1983)提出“凝集素组织化学”，而不是“凝集素免疫组织化学”二、实验原理细胞膜的渗透性（1）细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障，是一种半透膜，使细胞具有相对稳定的内环境，同时在细胞与环境之间的物质运输、能量交换及信息传递过程中也起着重要作用。（2）将红细胞放入低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可以使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象成为溶血（hemolysis）。（3）由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同，因此，发生溶血现象所需的时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的指标。二、实验原理植物凝集素细胞膜的渗透性三、实验用品1.实验材料马铃薯块茎和韭菜叶片，2%鸡血红细胞悬浮液。2.实验试剂（1）磷酸盐缓冲液：分别称取氯化钠7.2g和磷酸氢二钠1.48g，用蒸馏水溶解，混合后用蒸馏水定容至1000mL，调pH值至7.2。（2）渗透试剂：低渗、等渗和高渗透溶液。（3）生理盐水。3.器材光学显微镜、研钵、离心管、离心机和载玻片等。四、实验操作1.马铃薯块茎中的凝集素对红细胞的凝集反应（1）马铃薯去皮，称取块茎4g，置于研钵中。（2）加少许（5~10mL）磷酸盐缓冲液研磨成匀浆。（3）最终加到30mL磷酸盐缓冲液，浸泡2h备用。（4）取两片载玻片，自来水洗干净，晾干，备用。（5）用吸管吸取马铃薯凝集素的粗提液和2%鸡血细胞液各一滴置于载玻片上，充分混匀静置10min。（6）低倍显微镜下观察发生凝集现象。注意：要吸取马铃薯凝集素粗提液的上层澄清部分；注意观察比较视野中细胞团块大小和游离细胞的数量、分布；设计一个对照试验，观察细胞未发生凝集反应的现象？？2.韭菜叶中的凝集素对红细胞的凝集反应（1）取韭菜叶片3-5g，用蒸馏水洗净剪碎；（2）按1:1（质量/体积）加入生理盐水，用研钵磨成匀浆；（3）两层纱布过滤于烧杯中，滤液在5000r/min离心20min，弃沉淀，留上清；方案1：（4）用量筒量取上清液体积，加硫酸铵至60%饱和度；（5）5000r/m离心20min，沉淀用1mL磷酸盐缓冲液溶解（C）；方案2：（4）准确量取上清液体积后，加硫酸铵至80%饱和度；（5）5000r/m离心20min，沉...
