1.限制酶的选择原则（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”， 如图甲可选择 PstⅠ。②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因， 如图甲不能选择 SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和 EcoR Ⅰ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点） ，而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动子和终止子。（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶pst Ⅰ因其会破坏标记基因而不宜选择。③所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。④所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙中HindⅢ会破坏启动子，EcoRⅠ会破坏终止子， 而 NdeⅠ和 BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。（3）参考 Ti 质粒的 T－DNA 片段选择限制酶若质粒上标出 T－DNA 片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA 片段中，从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA 片段上 —— 因为 Ti 质粒的 T－DNA 片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA 上，如用两种限制酶Xba Ⅰ和Sac Ⅰ（两种酶切出的黏性末端不同）切割某DNA ，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则下图中甲、乙、丁，Ti 质粒均不宜选择，而丙 Ti 质粒宜选取。（分析如下）2.目的基因的检测与鉴定（1）界定“标记基因”与“DNA 分子杂交技术”在目的基因检测中的作用：①载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。 当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达， 使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含该载体，原理如下图所示...
